Caracterización del dominio carboxilo-terminal de la GTPasa de bucle GPN Npa3 en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

"La GTPasa de bucle GPN 1 de levadura (Npa3) participa en el ensamblaje y translocación nuclear de la RNA polimerasa II (RNAPII). Npa3 posee un dominio de GTPasa (N-terminal) con una extensión en su dominio carboxilo-terminal (C terminal) presente únicamente en eucariontes, y ausente en su único ortólogo de arqueas. Previamente, se reportó que el C-terminal tiene funciones no relacionadas con la RNAPII, debido a que células que expresaban una versión trunca de Npa3 carente de los últimos 106 aminoácidos del C-terminal (npa3∆C) mostraron una RNAPII con localización nuclear normal, pero una mayor sensibilidad a la higromicina B y geneticina. Asimismo, un análisis de matrices genéticas sintéticas arrojó que la mutante npa3∆C tenía una fuerte interacción genética negativa con genes en diferentes procesos celulares, y particularmente con la mutante bud27∆. A pesar de esto, se conoce muy poco sobre cómo funciona o se regula el C-terminal de Npa3. En este trabajo, se muestra que los C-terminal de Npa3 y de GPN1 humana tienen características estructurales propias de regiones intrínsecamente desordenadas con tres motivos de reconocimiento molecular (MoRFs). Ambos C terminal no comparten identidad en su secuencia primaria y, a pesar de esto, el C terminal de GPN1 pudo reemplazar parcialmente funciones del C-terminal de Npa3 en la levadura S. cerevisiae. Adicionalmente, se reportó que Npa3 se fosforila en once residuos de su C-terminal, pero se desconoce su importancia fisiológica. Células de levadura bud27∆ que expresan una versión no fosforilable de Npa3 (npa3-NP) con ocho de los once residuos fosforilables mutados a alanina, mostraron una mayor sensibilidad a higromicina B y cicloheximida que las células control. El mismo fenotipo se observó mutando únicamente el grupo Ser304/Ser308/Ser313 a alanina. En conclusión, en este trabajo se propone que la función del dominio GTPasa de Npa3 se regula fuertemente por la fosforilación de su extremo C terminal, una región intrínsecamente desordenada."

"Yeast GPN-loop GTPase 1 (Npa3) belongs to a family of GTPases involved in the assembly and nuclear targeting of RNA polymerase II (RNAPII). Npa3 features an N-terminal GTPase domain (G-domain) and an extended C-terminal domain (CTD), which is present exclusively in eukaryotes and absent in the sole GPN protein ortholog found in archaea. Previously, we reported that Npa3 possesses additional functions unrelated to RNAPII. Yeast cells expressing a truncated version of Npa3 lacking the last 106 amino acids (npa3∆C) displayed increased sensitivity to both the translation inhibitors hygromycin B and geneticin. Additionally, a synthetic genetic array analysis revealed that npa3∆C exhibited strong negative interactions with at least 15 genes involved in different cellular processes, most notably with bud27∆. However, very little is known about the function or regulatory mechanisms of Npa3 CTD. In this work, we show that the CTDs of Npa3 and GPN1 are predicted to be intrinsically disordered regions (IDRs) containing three molecular recognition features (MoRFs). As expected for an IDR region, yeast Npa3 and human GPN1 CTDs do not share conservation at their primary sequence level. Nonetheless, the GPN1 CTD can partially substitute for Npa3 CTD function in yeast. Furthermore, global proteomic studies have reported that Npa3 is mainly phosphorylated within its CTD, although its physiological relevance remains unknown. In yeast bud27∆ cells expressing a non-phosphorylatable version of Npa3 (npa3-NP), in which eight phosphorylatable residues were mutated to alanine, we observed increased sensitivity to hygromycin B and cycloheximide. A similar phenotype was displayed in cells expressing an Npa3-NP mutant with only the Ser304/Ser308/Ser313 cluster mutated to alanine. In conclusion, we propose that the function of the Npa3 G domain is critically regulated through phosphorylation of the S304/S308/S313 cluster within its disordered CTD."