Caracterización estructural y bioquímica de la esterasa termoestable Ta0887 de Thermoplasma acidophilum

Abstract

"Las esterasas microbianas son enzimas versátiles y estables con una amplia variedad de aplicaciones biotecnológicas. Sin embargo, pocas esterasas han sido caracterizadas de arqueas, una fuente importante de enzimas extremófilas. En este estudio, presentamos la caracterización bioquímica y la estructura cristalina de Ta0887, una nueva esterasa de la arquea termoacidófila Thermoplasma acidophilum. La proteína se clonó, expresó y purificó exitosamente como proteína recombinante en Escherichia coli. Los ensayos de dispersión de luz revelaron que Ta0887 es un monómero en solución. Los ensayos de actividad utilizando ésteres de p-nitrofenil (p-NP) confirmaron su actividad esterasa, mostrando una preferencia de sustrato por p-NP hexanoato (C6). La sustitución del residuo de serina en la posición 95 por alanina resultó en la abolición completa de la actividad enzimática, confirmando así su papel esencial como el residuo nucleofílico de la tríada catalítica. La enzima presentó una actividad óptima a 65 °C y pH 8.0. De manera notable, Ta0887 exhibió una elevada estabilidad térmica, reteniendo un 66% de actividad residual tras incubarse a 80 °C por 2 horas, en concordancia con su punto medio de desnaturalización térmica de 80.6 °C. La estructura cristalina de Ta0887, resuelta a 1.93 Å, reveló un dominio central α/β-hidrolasa constituido por una lámina β de ocho hebras, rodeadas por siete hélices α, y un dominio tapa compuesto por cuatro hélices α. Ta0887 presenta un bolsillo de unión al sustrato amplio en la interfaz entre los dos dominios, que contiene los residuos conservados Ser95, Asp187 y His215 de la tríada catalítica. Hasta donde sabemos, esta es la primera esterasa caracterizada de T. acidophilum. Los hallazgos de este estudio proporcionan una base para la futura ingeniería de Ta0887 con el objetivo de mejorar su potencial para aplicaciones industriales y biotecnológicas."

"Microbial esterases are versatile and stable enzymes with a wide range of biotechnological applications. However, few esterases have been characterized from archaea, an important source of extremophilic enzymes. In this study, we report the biochemical characterization and crystal structure of Ta0887, a novel esterase from the thermoacidophilic archaeon Thermoplasma acidophilum. The protein was successfully cloned, expressed, and purified as a recombinant protein in Escherichia coli. Light-scattering assays revealed that Ta0887 is a monomer in solution. Activity assays using p-nitrophenyl (p-NP) esters confirmed its esterase activity, showing a substrate preference for p-NP hexanoate (C6). The substitution of the serine residue at position 95 for alanine resulted in the complete abolition of enzymatic activity, thereby confirming its essential role as the nucleophilic residue of the catalytic triad. The enzyme exhibited optimal activity at 65 °C and pH of 8.0. Notably, Ta0887 displayed high thermal stability, retaining 66% residual activity after incubation at 80 °C for 2 hours, consistent with its thermal denaturation mid-point temperature of 80.6 °C. The crystal structure of Ta0887, resolved at 1.93 A, revealed an α/β-hydrolase core domain consisting of an eight-strand β-sheet, surrounded by seven α-helices, and a cap domain comprising four α-helices. Ta0887 features a large substrate-binding pocket at the interface between the two domains that contains the conserved residues Ser95, Asp187, and His215 of the catalytic triad. To our knowledge, this is the first characterized esterase from T. acidophilum. The findings from this study provide a basis for the future engineering of Ta0887 with the aim of enhancing its potential for industrial and biotechnological applications."