Tipos de papilomavirus de alto riesgo circulantes en mujeres de San Luis Potosí y Guanajuato

Abstract

"Determinar la frecuencia de los tipos de papilomavirus humano (HPV) de alto riesgo (AR) en las lesiones preneoplásicas y neoplásicas del cérvix en los estados de San Luis Potosí (SLP) y Guanajuato. MÉTODOS. Incluimos 370 muestras de exudado cervical de 250 mujeres de SLP y 120 de Guanajuato con displasia leve, moderada, severa o cáncer cervicouterino (CaCu) invasor. Para detectar HPV empleamos la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con tres parejas de oligonucleótidos universales: una que amplifica parte del gen L1 (MY09/11) en una reacción convencional y dos que amplifican la región E6/E7 de HPV de alto riesgo (AR) mediante PCR anidada (parejas de la primera reacción: LCRS/E7AS; de la segunda: pU 1M/2R). Para la amplificación incluimos tres controles (positivo: DNA de células HeLa; housekeeping: gen de β-globina; negativo: agua). Identificamos siete tipos de HPV-AR (-16, -18, -31, -33, -35, -52, -58) con el método de Fujinaga et al. (J Gen Virol 72:1039-44, 1991), basado en el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del producto E6/E7 de ~250 pares de bases. RESULTADOS. Obtuvimos 0.053-166.95 μg de DNA por muestra; ≤ 100 ng en cinco y ≥ 100 ng en las 365 muestras restantes. Al comparar la amplificación de E6/E7 por PCR directa y anidada en 30 muestras, obtuvimos 11 positivas con la primera reacción (36.7%) y 24 (80%) con la reacción anidada, por lo cual decidimos emplear ésta en el trabajo. Empleamos un algoritmo de tres pasos para obtener los productos de HPV y determinar la amplificabilidad del DNA: 1) PCR anidada para E6/E7 → 2) PCR para L1 en muestras negativas del primer paso → 3) PCR de β-globina en muestras negativas del segundo paso. En 365 muestras (98.6%) obtuvimos amplicones de E6/E7, L1 o β-globina y de HPV en 362 (97.9%): de E6/E7 en 331 (89.5%) y de L1 en 31 (8.4%); en tres muestras (0.8%) sólo obtuvimos amplicones de β-globina. No fueron amplificables cinco muestras (1.4%) que contenían ≤ 100 ng de DNA. Para identificar los 331 amplicones de HPV-AR empleamos un algoritmo de dos pasos: 1) restricción de los productos E6/E7 ~250 pb con AvaII → 2) restricción de los productos AvaII-resistentes con RsaI-BglII-AvaI-AccI. La frecuencia general de los tipos de HPV-AR en los dos estados fue: HPV-16 (60.5%), -31 (13.4%), -18 (10.3%), -52 (6.8%), -35 (5.6%), -33 (1.5%) y -58 (1.0%). Había dos tipos de HPV-AR en 69 muestras (20.8%) y tres tipos en cinco muestras (1.5%). La frecuencia de los tipos de HPVAR en las infecciones dobles fue, en orden descendente: HPV-16 (42.0%), -31 (18.8%), -52 (12.3%), -35 (11.6%), -18 (10.9%), -58 (2.2%) y -33 (1.5%); y en éstas el tercer tipo más frecuente fue HPV-18 en SLP y HPV-52 en Guanajuato. Identificamos infecciones triples en SLP pero no en Guanajuato y en ellas la frecuencia fue, en orden descendente: HPV-16, -31, -35, -52 y -18. CONCLUSIONES. Con los métodos empleados la inmensa mayoría (98.6%) de las muestras contienen suficiente DNA (≥ 100 ng) para tipificar HPV-AR. Para detectar HPV-AR la PCR anidada de E6/E7 es unas dos veces más sensible que la PCR directa. Los dos algoritmos empleados permiten la detección y tipificación eficiente de HPV-AR. La inmensa mayoría de las muestras de lesiones preneoplásicas y neoplásicas del cérvix incluidas en el trabajo contienen HPV (97.9%); la frecuencia de la infección cervical por HPV-AR fue 84.8% en SLP y 99.2% en Guanajuato. Los siete tipos de HPV-AR identificables con el método empleado circulan en SLP y seis Guanajuato. La quinta parte de las muestras tienen infecciones dobles o triples, con gran predominio de las dobles (93%). En las mujeres de SLP/Guanajuato con lesiones del cérvix las frecuencias porcentuales de los tipos de HPV-AR son: HPV-16 (62.6/56.4), -31 (11.9/16.4)-18 (10.4/10.0), -52 (6.3/7.9), -35 (5.9/5.0), -33 (1.1/2.1), y -58 (1.5/0)."

"OBJECTIVE: To determine the frequency of high risk (HR) human papillomavirus (HPV) types in preneoplastic and neoplastic cervical lesions in the states of San Luis Potosí (SLP) and Guanajuato, Mexico. METHODS: 370 cervical scrapings from 250 women from SLP and 120 from Guanajuato with slight, moderate or severe dysplasia, or invasive cervical cancer were analyzed. HPV detection was performed with the polymerase chain reaction (PCR) using three universal primer pairs: one which amplifies the L1 gene (MY09/11) in a conventional reaction, and two which amplify the E6/E7 region of HR-HPV through a nested PCR (pair of the first reaction: LCRS/E7AS; pair of the second reaction: pU 1M/2R). Three controls were included in PCR mixtures (positive: HeLa DNA; housekeeping: β-globin; negative: water). Seven HR-HPV (-16, -18, -31, -33, -35, -52, -58) can be identified with the method of Fujinaga et al. (J Gen Virol 72:1039-44, 1991) based on restriction fragment length polymorphism (RFLP) of the ∼250-base pair PCR product. RESULTS: Amounts of DNA ranging from 0.053 to 166.95 μg were obtained from all samples; five contained ≤ 100 ng and the remaining 365 contained ≥ 100 ng. E6/E7 amplification by direct and nested PCR was compared in 30 samples: 11 were positive with direct PCR (36.7%) and 24 with nested PCR (80%); for this reason nested PCR was used for HPV detection. The following three-step algorithm was used to generate HPV products and to determine DNA amplificability: 1) nested E6/E7 PCR → 2) L1 PCR for the negative samples of the first step → 3) β-globin PCR for the negative samples of the second-step. E6/E7, L1 or β-globin products were obtained in 365 samples (98.6%); HPV products in 362 samples (97.9%): E6/E7 in 331 (89.5%) and L1 in 31 (8.4%); only β-globin products were amplified in three samples (0.8%). The five samples containing ≥ 100 ng of DNA did not amplify any PCR product. The following two-step algorithm was used to genotype HRHPV: 1) restriction of the E6/E7 ~250 bp products with Ava II → 2) restriction of the AvaII-insensitive products with RsaI-BglII-AvaI-AccI. The general frequency of HR-HPV types in both states was: HPV-16 (60.5%), -31 (13.4%), -18 (10.3%), -52 (6.8%), -35 (5.6%), -33 (1.5%) and -58 (1.0%). Two HR-HPV types were identified in 69 samples (20.8%) and three types in five samples (1.5%). The frequency of HR-HPV types in double infections was: HPV-16 (42.0%), -31 (18.8%), -52 (12.3%), -35 (11.6%), -18 (10.9%), -58 (2.2%) and - 33 (1.5%); the third most frequent HR-HPV type in these cases was HPV-18 in SLP and HPV-52 in Guanajuato. Triple infections were detected in SLP but not in Guanajuato and the HR-HPV type frequency was, in descending order: HPV-16, -31, -35, -52 and -18. CONCLUSIONS: With the methods used here we obtained enough DNA (≥ 100 ng) from almost all samples (98.6%) in order to genotype HR-HPVs. E6/E7 HR-HPV detection is two times more sensitive with nested than with conventional PCR. The two algorithms developed allow efficient HR-HPV detection and genotyping. Almost all preneoplastic and neoplastic cervical samples included contain HPV (97.9%); the frequency of HR-HPV cervical infection is 84.8% in SLP and 99.2% in Guanajuato. All seven identifiable HR-HPV types were found in SLP and six in Guanajuato. One-fifth of the samples have double or triple infections where the first predominate (93%). The frequencies (per cent) of HR-PPV types in women from SLP/Guanajuato with cervical lesions are: HPV-16 (62.6/56.4), -31 (11.9/16.4)-18 (10.4/10.0), -52 (6.3/7.9), -35 (5.9/5.0), -33 (1.1/2.1), and -58 (1.5/0)."