Clonación y caracterización de los Superóxido Dismutasa de Amaranto expresada en respuesta a estrés abiótico.

Abstract

"El estrés oxidativo o incremento de especies reactivas de oxígeno (ERO) en plantas generalmente acompaña a diferentes tipos de estrés abiótico como sequía, altas temperaturas y salinidad, afectando la productividad de los cultivos y debido a esto se ha incrementado el estudio de estrés en plantas. Por otro lado, existe el interés mundial de contar con cultivos alternos capaces de producir alimentos. El amaranto es una planta que produce semillas de alta calidad nutritiva y nutraceútica, la planta puede crecer en zonas áridas donde los cultivos tradicionales no logran sobrevivir. En nuestro grupo de trabajo se ha realizado un estudio proteómico comparativo sobre la repuesta de la planta el déficit de agua. De este estudio se encontró el aumento de concentración de una Superóxido Dismutasa (SOD). Las SOD son la primera línea de defensa contra el estrés oxidativo, ocasiona la dismutación del anión superóxido produciendo peróxido de hidrógeno y oxígeno. Existen isoformas de SOD que varían por el co-factor al cual se unen: Cu,Zn-SOD, Fe-SOD, Mn-SOD y Ni-SOD. A partir de los datos de proteínas se diseñaron oligonucleótidos para SOD y se obtuvo un fragmento de 263 pb con homología a Cu,Zn SOD. A partir del fragmento de 263 pb se realizó un RACE al extremo 3’ y 5’ obteniendo un ORF de 459 pb de SOD de amaranto (AhSOD). AhSOD mostró una identidad mayor del 80% con otras Cu,Zn SOD. El gen se clonó en el vector de expresión pET22b(+) y se transformó la cepa de Escherichia coli BL21(DE3) para su sobreexpresión. La proteína recombinante se encontró en la fracción soluble y fue purificada por cromatografía de afinidad. El ensayo de actividad mostró que la AhSOD puede expresarse de forma activa en E. coli AhSOD puede ser empleado para la transformación de plantas con el fin de incrementar su capacidad de acción contra las especies reactivas de oxígeno con el resultado en el aumento de productividad."

"Oxidative stress or increased of reactive oxygen species (ROS) in plants generally is related with different abiotic stress as water deficit, high temperatures and salinity, affecting the crop productivity and hence, the interest in the research of stress in plants. By other hand, there is interest worldwide to have alternative crops able to produce food with high nutritive and nutraceutical properties. The amaranth is a plant that produces seeds of high quality; the plants grows in arid zones where traditional plants are not able to grow. In our research group has reported a comparative proteomic study of the amaranth response to water deficit. From this, it was found the increased concentration of one superoxide dismutase (SOD) in drought conditions. SOD is the first line of defense against oxidative stress caused by the dismutation of superoxide anion and hydrogen peroxide to produce oxygen. SOD isoforms exist which differ by the factor which co-bind: Cu,Zn- SOD, Fe-SOD, and Mn-SOD. From MS data it was designed the oligonucleotides for SOD amplification from cDNA,, obtaining a fragment of 263 bp corresponding to Cu,Zn-SOD. From the fragment of 263 bp were amplified by RACE at 5’ and 3’ end obtaining the complete ORF of 459 bp for amaranth SOD (AhSOD). The multiple alignments AhSOD and SODs from various plants showed an identity above 80 % with Cu,Zn-SOD. AhSOD was cloned on the expression vector pET22b(+) and the strain of Escherichia coli BL21(DE3) was transformed. The recombinant protein, found in the soluble fraction was purified by ion exchange chromatography. The activity assay showed that recombinant AhSOD was active. AhSOD could be used for plant transformation to increased the capacity against reactive oxygen species with the resulting increased in productivity."