Desarrollo de métodos de diagnóstico molecular de enfermedades virales, bacterianas y fúngicas en hortalizas

Abstract

"La horticultura es una de las actividades agrícolas de mayor importancia económica en nuestro país, destacando en ella el cultivo del tomate y el chile. Entre los principales factores que limitan la producción de hortalizas figuran las enfermedades causadas por virus, bacterias, fitoplasmas y hongos. Los problemas fitosanitarios provocados por estos agentes biológicos, y sus graves secuelas económicas, pueden disminuirse enormemente a través del diagnóstico preciso y oportuno de las enfermedades que surgen en los campos agrícolas, lo que permite adoptar de manera rápida medidas para controlar la propagación de los patógenos. El desarrollo de técnicas moleculares para el diagnóstico de enfermedades ha beneficiado de manera extraordinaria a la agricultura de países avanzados, pero en México estas tecnologías se usan todavía de modo esporádico y a pequeña escala. En el estado de San Luis Potosí, que es un productor importante de tomate y otras hortalizas, no existía hasta muy recientemente ningún laboratorio o centro de investigación que realizase diagnóstico fitopatológico por métodos moleculares. El presente trabajo representa el primer esfuerzo sistematizado para implementar en este Estado una serie de técnicas basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para el diagnóstico e identificación de los fitopatógenos bacterianos, fúngicos y virales que con más frecuencia afectan a los cultivos hortícolas del Estado. El trabajo de investigación que aquí presentamos consta de dos partes distintas, que solo tienen en común el uso de técnicas basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y el objetivo de identificar fitopatógenos. En la primera parte se estandarizaron técnicas moleculares para el diagnóstico de algunas enfermedades bacterianas y fúngicas del jitomate y el chile que tienen gran incidencia en el altiplano potosino. Se establecieron métodos de extracción de ADN a partir de muestras de tejido vegetal enfermo y de cultivos axénicos de algunos patógenos, y se desarrolló un método especial de extracción de ADN de microorganismos presentes en el suelo que mostró ser muy eficiente. Se probaron varios pares de oligonucleótidos sintéticos previamente diseñados para el diagnóstico de fitopatógenos específicos, y se determinaron las condiciones más apropiadas para llevar a cabo la amplificación del ADN con cada uno de esos juegos de iniciadores. Mediante estas técnicas se logró la detección del agente causal del llamado “cáncer bacteriano” Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis en tejidos vegetales, semillas y suelos infestados provenientes de varias áreas hortícolas del Altiplano. Se detectó también por técnicas moleculares una fitoplasmosis del jitomate transmitida por el psílido Bactericerca (= Paratrioza) cockerelli en la región de Arista y el Huizache. Esta enfermedad fue devastadora y se demostró que su etiología es diferente al Big bud y Aster yellow que son fitoplasmosis bien caracterizadas del tomate. Finalmente, se identificaron mediante el uso de los iniciadores ITS1 e ITS4, a los siguientes hongos en cultivos hortícolas de la región: Phytophthora capsici (marchitez del chile), Rhizoctonia solani (marchitez del chile) y Alternaria arborescens (cáncer del tallo del jitomate). También se detectó por PCR, y por análisis microbiológico paralelo, al llamado “tizón temprano” (Alternaria solani), y se logró determinar que un síndrome de marchitez era provocado por una combinación de Rhizoctonia solani y Fusarium sp. Los resultados del diagnóstico molecular fueron útiles a los productores de los campos hortícolas que se inspeccionaron durante el estudio, e hicieron posible la elección de los tratamientos de control fitosanitario pertinentes. El segundo proyecto de investigación que integra el presente trabajo se orientó al desarrollo de nuevos métodos moleculares para el diagnóstico e identificación de begomovirus, un subgrupo de la familia de los geminivirus que ha causado en la última década daños muy severos a la agricultura de nuestro país y otros países latinoamericanos. Estos virus poseen un genoma de DNA circular y de cadena sencilla, son transmitidos por la mosquita blanca (Bemisia tabaci), e infectan a una gran variedad de plantas dicotiledóneas, incluyendo al chile, el tomate, la calabaza y otras hortalizas. Se diseñaron y probaron experimentalmente 8 nuevos iniciadores “universales” que permitieron amplificar diferentes regiones del genoma A de begomovirus representativos de América, Europa, y África. Con un par de estos iniciadores, Rep-Mot y pCPc70, se amplificó una región genómica que permite distinguir, por la simple observación de la movilidad electroforética relativa de los productos de PCR, a los begomovirus de América de aquellos que provienen de otros continentes. La capacidad del método para identificar de modo preliminar a los virus se incrementó substancialmente al combinar la PCR con el análisis del patrón de restricción del DNA viral obtenido con las enzimas Msp1 y Hha1. Este nuevo método de tipo PCR-RFLP hace factible la estimación rápida y confiable de la diversidad de especies virales en una región geográfica dada, y aumenta la resolución de las técnicas moleculares para detectar infecciones múltiples, como se pudo demostrar en el presente estudio. Adicionalmente, se identificaron variantes del virus huasteco de chile (PHV) en muestras de jitomate y chile provenientes de diversas regiones del país. Con la combinación de otro juego de iniciadores universales se logró amplificar, por la técnica de PCR anidado, una región del genoma viral que contiene dos promotores divergentes, de tal forma que los productos de PCR resultantes pueden ser utilizados adicionalmente como fuente de promotores susceptibles de uso en la ingeniería genética de plantas. Los métodos para el diagnóstico e identificación de begomovirus que desarrollamos en el presente trabajo son más sencillos y sensibles, involucran menores costos, y son más versátiles que otros métodos moleculares publicados y actualmente utilizados en los laboratorios de fitopatología de muchos países."

"Horticulture is one of the farming activities of most importance in Mexico. The main horticultural crops (hortcrops) are tomato and pepper and some of the main limitation factors in hortcrops production are the diseases caused by fungi, bacterias, phytoplasms, viruses and nematodes. Reduction of phytopathologic problems and economic losses caused by plant diseases can be addressed through an opportune and reliable diagnosis both in greenhouses as in field. Once the pathogenic agent is identified, corrective actions can be undertaken in order to avoid greater losses of these agricultural commodities. The development of molecular biology techniques for plant diseases diagnostic, have contributed in reduction of losses and also in the selection of proper disease control treatments mainly in developed countries, however these techniques are available in very few places in Mexico. San Luis Potosi (SLP), is one of the major producers in Mexico of tomato and other hortcrops of economic importance, nevertheless there was not previous report of private laboratories or research groups focused to develop molecular protocols for hortcrops disease diagnosis in this State, in spite of the serious problems of crop losses caused by pathogenic organisms the last agronomic cycles. The current research work aimed to develop and adapt molecular methods for the reliable identification of the main pathogenic agents in the hortcrops regions of SLP. The work was divided in two sections. In the first one, several methods for bacteria, fungi, and phytoplasms detection were adapted and standardized for reference strains and different complex matrix such as infected plant tissues and soil, both for tomato and pepper. One of the critical steps is the quality of DNA analyzed and therefore several DNA extraction methods were tested. The adapted ones allowed us to perform the diagnostic efficiently. The bacteria canker caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis , was detected in seeds, plant tissues and soil. This was one of the most devastating diseases found in Villa de Arista region. Also a phytoplasm osis with different etiology from Big bud or Aster yellow phytoplasms was detected. To our knowledge this is the first report using molecular methods of phytop lasm detection in SLP. In addition using the ITS1 and ITS4 primers, several fungi were detected: Phytophthora capsici (wilt pepper), Rhizoctonia solani (wilt pepper), Alternaria arborescens (tomato stem canker) and Alternaria solani (early blight). The fungi molecular diagnostic was confirmed by microbiological observation. It is important to mention that a syndrome was frequently observed caused by the presence of two fungi (Rhizoctonia solani and Fusarium sp.). These results allowed the farmers to choose the adequate control treatment to stop spreading of the diseases, resulting in a significant losses reduction. In the second section, a new PCR-based method for the identification of begomoviruses was developed. Geminiviruses are a diverse family of plant pathogens that produce devastating diseases in fiber and vegetable crops in tropical and subtropical agroecosystems worldwide. The genus Begomovirus is the most diversified and broadly distributed subgroup of the Geminiviridae family. The plethora of new begomoviruses isolated from diverse areas around the world requires the development of accurate and simple molecular methods for their rapid and precise identification. We have developed a PCR-based method that simplify the identification of begomoviruses and makes feasible the discovering of new species. This methodology uses new universal (degenerated) primers to amplify different, overlapping genomic segments of begomoviruses natives from America, Asia and Africa. A pair of these universal primers (i.e., pRepMot and pCPc70) flanking a viral region encompassing both conserved and variable sequences from the CP and Rep genes plus the intergenic region, were used to amplify viral DNA from infected plant tissues or cloned viruses. The size of the single PCR product was highly variable, ranging from more than 750 bp. in some Old World begomoviruses, to 580-570 bp in certain American viruses. Thus, observation of the relative electrophoretic mobility of the PCR products from field samples, allows to obtaining a preliminary estimation of begomovirus diversity in extensive geographical areas. Moreover, PCR products were digested with restriction enzymes like MspI and HhaI to establish a methodology that makes feasible the preliminary identification of begomovirus species by PCRRFLP. The viral region which is amplified with the pRepMot/pCPc70 primers contains two divergent promoters, and new universal primers were designed to selectively amplify the intergenic region encompassing them. This second amplified DNA can then be subcloned into specially designed vectors to directly generate two alternative gene expression cassettes, which could be used in plant biotechnology. The molecular methods developed in this study are more simple, cost effective and versatile than other published methods for begomovirus identification currently in use."