Fertilización in vitro en cerdos.

Abstract

"La fertilización in vitro (FIV), empleada con éxito a partir de 1980 para generar embriones humanos y de otras especies animales, se basa en el cocultivo de gametos femeninos madurados in vitro con espermatozoides capacitados. Tres problemas undamentales de la reproducción asistida del cerdo son la maduración de los ovocitos, la capacitación espermática y la polispermia. Para poder abordarlos en el futuro implementamos un método apropiado para la FIV del cerdo en cuatro etapas: obtención de complejos cúmulo-ovocito (CCO), maduración in vitro (MIV) de CCO, capacitación de espermatozoides0000 y cocultivo de gametos. Obtención de CCO. En cada experimento fueron empleados 10 ovarios de hembras de talla comercial, transportados del rastro al laboratorio en soluciónsalina amortiguada con fosfatos a 4°C con penicilina, estreptomicina y anfotericina. Los CCO fueron aislados a partir de folículos de 0.3-6 mm de diámetro mediante corte con bisturí; la tasa de extracción fue ~1.5 CCO/min y la liberación fue lograda agitando el ovario sumergido en medio de Dulbecco con antibióticos. Los CCO liberados fueron aspirados con micropipeta bajo el estereomicroscopio y clasificados por su aspecto: tipo 1, CCO degradados; tipo 2, sin células del cúmulo; tipos 3 y 4 con células del cúmulo disminuidas en número; tipo 5, con el máximo número de células del cúmulo compactas y uniformes. Para la MIV lostipos 3, 4 y 5, con potencial para madurar, representaron el 88% de los CCO aislados. MIV. Grupos de 30-40 CCO de los tipos 3-5 fueron incubados a 38.5°C durante dos periodos sucesivos de 22 h en atmósfera húmeda con CO2 al 5%; el primer periodo en medio 199 con hormona luteinizante y folículoestimulante y el segundo en el mismo medio sin hormonas. Los cambios microscópicos indicativos de maduración de los CCO aptos para FIV fueron:1) aspecto viable (tipo 3-5), 2) células del cúmulo aumentadas en número y tamaño y 3) aparición de zona pelúcida. El 77% de los CCO maduraron in vitro con predominio del tipo 5 (37%), seguido de los tipos 3 (21%) y 4 (19%). Capacitación. Los espermatozoides porcinos (adquiridos de Pig improvement, lote No. 337) a una concentración de 3×106/ml fueron diluidos en medio de Dulbecco a 15×105/ml e incubados 1.5 h a 37°C en atmósfera húmeda con CO2 al 5% para volverlos hipermótiles (indicador principal de la capacitación). Cocultivo. El cocultivo de 30-35 CCO maduros con 75 ml espermatozoides capacitados (1 CCO/3,500 espermatozoides) fue llevado a cabo mediante incubación por 6 h a 38.5°C en 100 ml de medio 199 en atmósfera húmeda con CO2 al 5%. El éxito de la FIV y por tanto de los procesos previos de MIV y capacitación fue sugeridoo por la penetración de espermatozoides al óvulo. Con este método podremos abordar los problemas mencionados antes de la FIV de cerdos."

"In vitro fertilization (IVF), successfully used since 1980 to generate human and other animal embryos, is based in the in vitro coculture of mature female gametes with capacitated spermatozoa. Three major problems of assisted pig reproduction are oocyte maturation, sperm capacitation and polispermy. In order to approach them in the future we implemented an appropriate pig IVF method in four stages: obtention of cummulus-oocyte complexes (COC’s), in vitro maturation (IVM) of COC’s, sperm capacitation, and gamete coculture. Obtention of COC’s. In each experiment 10 ovaries from commercial-size females were used, transported from the slaughterhouse to the laboratory in phosphate-buffered saline containing penicillin, streptomycin and amphotericin at 4°C. COC’s were isolated by scalpel section of 0.3-6 mm-diameter follicles; the rate of extraction was ~1.5 CCO/min and release was attained by shaking the ovary in Dulbecco’s culture medium. Released COC’s were aspirated with a micropipette under a stereomicroscope and classified by their aspect: type 1, degraded COC’s; type 2, without cummulus cells; types 3 and 4 with cummulus cells decreased in number; type 5, with the maximum number of compact and uniform cummulus cells. For IVM, types 3, 4 and 5, with potential to mature, represented 88% of the isolated COC’s. IVM. Groups of 30-40 type 3-5 CCO’s were incubated at 38.5°C for two successive periods of 22 h in a humid atmosphere with 5% CO2; the first period in medium 199 with luteinizing and follicle-stimulating hormones and the second one in the same medium devoid of hormones. The microscopic changes indicating that matured CCO had become apt for IVF were: 1) viable aspect (type 3-5), 2) cummulus cells increased in number and size and 3) a distinctive pellucid zone. Seventy-seven percent of COC’s matured in vitro with predominance of the type 5 (37%), followed by types 3 (21%) and 4 (19%). Capacitation. Pig spermatozoa (purchased from Pig improvement, lot No. 337) at a concentration of 3×106/ml were diluted in Dulbecco’s medium at 15×105/ml and incubated for 1.5 h to 37°C in humid atmosphere with 5% CO2 to make them hypermotile (major indicator of capacitation). Coculture. Coculture of 30-40 mature CCO’s with capacitated spermatozoa (1 CCO/3,500 spermatozoa) was carried out by incubating them for 6 h at 38.5°C in 100 ml of medium 199 in a humid atmosphere with 5% CO2. Success of the IVF technique and therefore of the previous IVM and capacitation processes was suggested by the penetration of spermatozoa to oocytes. With this method we expect to approach the pig IVF problems mentioned above."