Expresión, purificación y caracterización de la enzima CGI58/ABHD5

Abstract

"CGI58/ABHD5 es una enzima que participa en el metabolismo de lipidos como activador de la triglicerido lipasa del tejido adiposo(ATGL). Recientemente se ha descrito que CGI58 tiene actividador de lisofosfatidil aciltrasferasa, por lo que se le ha relacionado con procesos de señalizacion en la produccion de lipidos eicosanoides. A pesar de que CGI58 ha sido objeto de numerosos trabajos de investigacion, a la fecha sus estructura tridimensional no ha sido determinada. El objetivo central de este trabajo fue obtener una construccion de CGI58 que se exprese de forma soluble y a una concentracion adecuada para iniciar experimentos de cristalizacion asi resolver su estructura tridimensional por difracción de rayos X. Aqui reportamos el modelo por homologia de CGI58 de humano realizado con I-TASER, el cual se úso para diseñar una construccion deletada de 50 residuos en el extremo N-Terminal. Se generaron seis construcciónes de CGI58, dos con la secuencuia de ráton y cuatro con la de humano, que codifican para la enzima silvestre y una deletada. Cuatro de las seis construcciónes han sido expresadas como proteinas recombinantes en E.coli, la purificación de las mismas ha sido estandarizada utilizando cromatografia de afinidad a niquel. Hemos determinado que el detergente octil glucosido, permite aumentar la concentración de proteina soluble aproximadamente diez veces. Finalmente, observamos que el uso de glicerol al 10%.magnesio 2mM y pH 7.5 tienen un impacto positivo en CGI58. Sin embargo, queda pendiente evaluar el uso de estos aditivos en el proceso de purificación."

"CGI58/ABHD5 is an enzyme that participates in the lipid metabolism as an activator of adipose triglyceride lipase (ATGL). Recently it has been reported that CGI58 has a lysophosphatidyl acyltransferase activity, so it has been associated with the “signaling processes” in the production of eicosanoid lipids. Although CGI58 has been the subject of several studies, the three-dimensional structure has not yet been determined. The main goal of this work was to generate a construct that expresses CGI58 in a soluble form and at suitable concentration to initiate crystallization experiments; this will allow us to solve its structure by X-ray crystallography in the near future. Here, we report a homology model of human CGI58 performed with I-TASSER, which was used to design a truncated protein of 50 residues at the N-terminus. Two constructs of mouse CGI58 were generated,comprising the wild type and the truncated enzymes. Two optimized DNA sequences for the human CGI58 were designed, for each one we have the corresponding construct that express the wild type and the truncated enzyme. So, six protein constructs were generated in this work. Four of the six constructs have been expressed as recombinant proteins in E. coli; all of them have been purified by nickel affinity chromatography. We found that the detergent octyl glucoside increases the soluble protein concentration about ten fold. Finally, we observed that the use of 10% glycerol, 2 mM magnesium and pH 7.5 had a positive impact on CGI58 thermal stability. However, the evaluation of these additives in the purification step has not been tested yet."