Construcción de vectores para la generación de cepas Knockdown y sobreexpresantes con proteinas etiquetadas en el hongo filamentoso Trichoderma atroviride.

Abstract

"El hongo filamentoso Trichoderma atroviride es utilizado como agente de biocontrol debido a que induce la resistencia sistémica a patógenos en plantas, produce antibióticos y enzimas líticas. Adicionalmente, este hongo se utiliza como modelo fotomorfogénico debido a que conidia en respuesta a un pulso de luz azul. Las proteínas BLR-1, BLR-2 y TGF-1 juegan papeles muy importantes en la respuesta a la luz azul. A pesar de la importancia de éste hongo en la ciencia básica y la aplicada, los estudios a nivel molecular han sido limitados debido a la carencia de herramientas moleculares para su estudio. En el presente trabajo generamos vectores para el reemplazo de genes esenciales o que provoquen fenotipos aberrantes en T. atroviride. Los vectores portan el promotor inducible Pqa-2 del hongo Neurospora crassa (que responde a la presencia del ácido quínico en el medio de cultivo), el terminador TtrpC del hongo Aspergillus nidulans, el marcador de selección hph y las etiquetas FLAG o c-Myc para la obtención de proteínas etiquetadas en sus extremos amino o carboxilo. Los genes blr-2 y tgf-1, fueron clonados en algunas de las cuatro variantes de los vectores, las cuales fueron utilizadas para transformar a T. atroviride, obteniendo un set de cepas portadoras del gen blr-2 o cepas co-transformadas con los genes blr-2 y tgf-1. El análisis de las transformantes mostró fenotipos de hiperconidiación. La conidiación se potenció conforme se incrementó la concentración del inductor en el medio de cultivo, lo que sugirió la posible inducción de la actividad del Pqa-2 modulando la expresión del gen blr-2 o de los genes blr-2 y tgf-1. Estos indican fuertemente que los vectores generados son funcionales en T. atroviride y muy probablemente lo sean en otros hongos filamentosos."

"The filamentous fungus Trichoderma atroviride is used as a biocontrol agent due that it induces the systemic resistance to pathogens in plants, produces and secrets a number of antibiotics and lysing enzymes. In addition, this fungus is also used as a photomorphogenic model due that it conidiates in response to a blue light pulse. The BLR-1, -2 and TGF-1 proteins play important roles in blue light response. Despite the importance of this fungus in basic and applied science, its molecular studies have been scarce, because of the lacking of molecular tools. In this work we generated molecular vectors for the replacement of essential genes or those that provokes aberrant phenotypes in T. atroviride. These vector harbors the Pqa-2 inducible promoter from fungus Neurospora crassa, that responds to the addition of quinic acid in the culture medium, them also carry the TtrpC terminator from the fungus Aspergillus nidulans, the hygromycin phosphotransferase selection cassette and sequences that encode for FLAG and c-Myc epitopes to obtain tagged proteins in their respective amino or carboxy termini. The blr-2 or tgf-1 genes were cloned in some of the four variants of the vectors, which were used to transform T. atroviride, obtaining a set of strains bearing the blr-2 gen or both the blr-2 and the tgf-1 genes. Analysis of the transformants showed hyperconidiation phenotypes, which was enhanced as the concentration of quinic acid was increased in the culture medium, which suggested the transcriptional modulation of blr-2 or tgf-1 and blr-2 together under the control of Pqa-2. These data hardly suggest that the system based on Pqa-2 and TtrpC is functional in T. atroviride and probably in other filamentous fungi."