Desarrollo de un protocolo óptimo para el estudio de complejos moleculares de ADN-proteína por medio de microscopía de fuerza atómica

Abstract

"En esta tesis se desarrolló un protocolo óptimo para el estudio de complejos moleculares de ADN-proteina mediante Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). La técnica de AFM ha sido extensamente utilizada para el estudio de moléculas biológicas, en particular ADN, debido a su alta resolución espacial y a que permite analizar muestras sin recurrir a tinciones o recubrimientos. En este trabajo de tesis revisamos diferentes preparaciones de muestra hasta establecer un protocolo óptimo para la visualización de moléculas de ADN (λ ADN y plásmidos) y complejos ADN-proteína, utilizando como proteína modelo la Uracilo-ADN glicosilasa (UDG). Estas moléculas se depositaron sobre dos sutratos: mica y mica modificada con APTES ( AP-mica). Se utilizaron dos métodos de deposición: el método convencional y el método de spin-coating. Concluimos que la mica es un sustrato favorable para la obtención de moléculas de ADN extendidas y aisladas, caso contrario al uso de AP-mica. El problema de inhomogeneidad en las muestras se resolvió mediante la técnica de spin-coating, lo cual nos permitió observar de manera reproducible complejos λ ADN-UDG. En estos experimentos el uso de formaldehído como agente de entrecruzamiento incrementa el número de complejos λ ADN-UDG observados por AFM. Resultados preliminares obtenidos en esta tesis sugieren que el mecanismo de reconocimiento del λ ADN por la UDG no ocurre por deformación del ADN (un mecanismo propuesto para otras proteínas reparadoras de ADN). "

"We developed an optimal protocol for studying molecular DNA-protein complexes using Atomic Force Microscopy (AFM). This technique has been used extensively for the study of biological molecules like DNA. It has a high spatial resolution and analyses performed does not require staining or coating samples. In this work, we used Uracil-DNA glycosylase (UDG), a model protein, and reviewed different sample preparation protocols establishing an optimal protocol for visualizating DNA (λ DNA and plasmids) and DNA-protein complexes. These molecules were deposited onto two substrates, mica and APTES-modified mica (AP-mica). Two methods were used deposition: the conventional method and the method of spin-coating. We conclude mica is a favorable substrate for the obtaining extended and isolated DNA molecules, unlike AP-mica. In regards with the deposition techniques used, the conventional method resulted in inhomogeneous samples and we observed the formation of different DNA superstructures on mica. Inhomogeneities were resolved by spin-coating technique, which allowed us to observe λ DNA-UDG complexes in a reproducible manner. In our experiments, the use of formaldehyde as a crosslinking agent increased the number of λ DNA-UDG complexes observed by AFM. Preliminary results obtained in this work suggest that the mechanism of λ DNA recognition by UDG does not occur by deformation of DNA (a mechanism proposed for other DNA-repair proteins)."