Delimitación experimental del dominio de unión especifica al DNA de la proteína de replicación de los geminivirus

Abstract

"Geminiviruses replicate by a rolling circle replication using host proteins. The only viral protein essential for this mechanism is the protein associated to replication (Rep). Rep recognizes iterative sequences in a specific form located in the origin of replciation and gives way to the beginning of rolling circle replication. Using a theoretical approach and based on structural analysis, a domain has been localized in Rep that could be involved in the specificity of iteron recognition. The domain (iteron-related domain) is located in the first 12 amino acids and is presumed to be the major specificity determinant. In this work, the IRD of Tomato Mottle Virus (ToMoV) has been replaced with the IRD of heterologous origin of replication. This result demonstrates that IRD is the major region inviolved in specific iteron recognition during geminivirus replication. However, despite the quimeric proteins recognize heterologous origin of replication they maintain a weakly recognition ot ToMoV´s replication origin. This observation suggests that there is another region in Rep protein that participates in the recognition of Replication origin or that the ToMoV´s repliation Origin is binding without high specificity."

"Los geminivirus se replican por un mecanismo de círculo rodante utilizando las proteínas del huésped. La única proteína viral esencial para este mecanismo de replicación es la proteína relacionada a la replicación, denominada Rep. La proteína Rep reconoce de manera específica secuencias cortas repetidas (iterones) presentes en el origen de replicación y después da inicio a la replicación por círculo rodante al introducir un corte endonucleolítico en la secuencia TAATATTAC, universalmente presente en los geminivirus. Estudios realizados mediante comparación de secuencias de las proteínas Rep de más de 240 especies de geminivirus, y mediante el análisis estructural de la proteína Rep de un begomovirus, Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) han permitido delimitar un dominio que parece estar implicado en el reconocimiento específico de los iterones. Este segmento proteico denominado Dominio Relacionado al iteron (IRD) comprende los primeros 11-12 aminoácidos de la proteína Rep y se ha propuesto como el principal determinante de especificidad de la replicación geminiviral. En el presente trabajo el IRD del Virus de Moteado de Tomate (ToMoV) se reemplazo con el IRD de otras especies de geminivirus, generando así proteínas Rep quiméricas. Mediante ensayos de replicación transitoria en protoplastos de tabaco, y en experimentos de infectividad in planta se pudo demostrar que las proteínas quiméricas poseen la capacidad de reconocer el origen de replicación de los virus donadores del IRD de Rep, produciendo infecciones sistémicas cuando los DNAAs genéticamente modificados se combinaron con los componentes genómicos B de las especies de las que se derivó el IRD. Estos resultados confirman experimentalmente que éste pequeño dominio de Rep es la región que determina principalmente la unión específica de la proteína viral a su origen de replicación cognado. Sin embargo, en experimentos de infectividad en plantas de Nicotiana benthamiana en los que los componentes genómicos A derivados de ToMoV se combinaron con el componente B de ese mismo begomovirus, se observó que las proteínas Rep quiméricas no perdieron del todo la capacidad de reconocer el origen de replicación de ToMoV, sugiriendo de ese modo la participación de otra región de la proteína Rep en el reconocimiento de los iterones, o alternativamente, que el origen de replicación de ToMoV es reconocido de modo relajado por las proteínas Rep quiméricas cuando éstas alcanzan una concentración elevada en las célula"