Identificación y caracterización de la proteína Bl-ARC y su posible papel en el mecanismo de pupilación en Bifidobacterium longum subsp. infantis

Abstract

"Oral administration of bifidobacteria improves intestinal flora in humans for stimulation of immune responses and possibly preventing cancer. Despite these relevant characteristics, information about molecular events is missing and the relationship along their host. In our laboratory we are studying the function of AAA proteins (ATPases Associated with diverse cellular Activities). AAA ATPases are involved in key cellular and molecular processes in all the organisms. In a previous study (M. Sc. Thesis), we found the gene IPR003593 AAA + ATPase core in Bifidobacterium longum genome. This gene codes a protein of 56.1 kDa with an AAA ATPase domain. Phylogenetic analysis positioned this sequence into the ARC AAA branch and we named it as Bl-ARC. N-terminal alignments of Bl-ARC grouped ATPases that participate in the degradation pathway via proteosome such as Rhodococcus erythropolis ARC, Archaeoglobus fulgidus PAN, Mycobacterium tuberculosis Mpa and the human proteasomal Rpt1 subunit. In the genome organization of B. longum, bl-arc is flanked by a cluster of genes that include pafA, pup and dop, all involved in substrate processing via pupylation. It has been described that B. longum lack the α y β proteosomal genes (prcA and prcB). This characteristic makes B. longum an attractive model to study the quality control of proteins and degradation processing. Preliminary structure analyses of Bl-ARC confirmed the formation of a homohexameric complex of 336 kDa. Enzymatic characterization showed Bl-ARC as an active ATPase Mg2+ and ATP dependent, and sensitive against N-ethylmaleimide (typical of AAA proteins). In addition, the Pup protein was analyzed by circular dicroism. Results showed an unruly pattern in its aminoacid sequence; this characteristic allows Pup to have flexibility to interact with other proteins and conduct them to degradation. In silico analysis of Dop and PafA revealed their structure are highly conserved against orthologues. This allowed the prediction of mechanisms based on their structure-function."

"La administración oral de bifidobacterias promueve el mantenimiento de la flora intestinal en humanos lo que estimula la respuesta inmune y tiene efectos preventivos en cáncer. A pesar de estas características altamente relevantes, poco se sabe de los eventos moleculares en este organismo y la relación con su hospedero. En nuestro laboratorio se estudian las funciones de las ATPasas de la familia AAA (ATPases Associated with diverse cellular Activities). ATPasas AAA están involucradas en procesos celulares y moleculares clave en todos los organismos. En un estudio previo (trabajo de tesis de Maestría), localizamos el gen IPR003593 AAA+ ATPase en el genoma de Bifidobacterium longum, cuya secuencia codifica una proteína de 56.1 kDa con un dominio característico AAA. Análisis filogenético permitió posicionarla dentro del grupo ARC AAA y denominarla Bl-ARC. Alineamientos del dominio N-terminal de Bl-ARC agrupó ATPasas que participan en la vía de degradación proteínica via proteosoma como ARC de Rhodococcus erythropolis, PAN de Methanococcus jannaschii, Mpa de Mycobacterium tuberculosis y la subunidad proteosomal Rpt1 de humano. En la organización genómica de B. longum, bl-arc está flanqueado por un grupo de genes que incluyen a pafA, pup y dop involucrados en el procesamiento de sustratos en el mecanismo de pupilación. No obstante, ha sido descrito que B. longum carece de los genes que codifican las subunidades α y β proteosomales (prcA y prcB). Estas características hacen aún más interesante el estudio del procesamiento de degradación y/o control de calidad de proteínas. Análisis estructurales preliminares de Bl-ARC confirmaron la formación de un complejo molecular homo-hexamérico de 336 kDa. La caracterización enzimática evidenció además actividad ATPásica en presencia de Mg+2 y ATP y sensibilidad en presencia de N-etilmaleimida (típico de proteínas AAA). Posteriormente se analizó la proteína Pup. Resultados del análisis de dicroísmo circular evidenciaron un patrón de desorden en su secuencia de aminoácidos; esta característica le confiere mayor flexibilidad para interactuar con otras proteínas para conducirlas a degradación. Análisis in silico de las proteínas Dop y PafA revelaron la conservación de sus estructuras y sitios clave contra proteínas ortólogas. Esto permitió la predicción de mecanismos basados en su estructura-función."