Estudio de la expresión de proteínas de interés biotecnológico en el citoplasma y periplasma de Escherichia coli recombinante: utilidad de fuentes de carbono alternas

Abstract

"En el presente estudio se utilizó la bacteria Gram negativa Escherichia coli para la expresión de proteínas recombinantes de alto valor agregado en el citoplasma y periplasma, utilizando fuentes de carbono de bajo costo, tal como fructosa de jugo de Agave y lactosa de suero de leche. La producción de interleucina-2 humana (rhIL-2) en el citoplasma de E. coli BL21-SI fue de 45 mg L-1 a 9 % de oxígeno disuelto (OD) y 10 g L-1 de fructosa de jugo de Agave. Para evaluar el efecto que tiene el OD y la concentración de lactosa de suero de leche sobre la producción de penicilino acilasa (PA) en E. coli W3110/pPA102, se diseñó un factorial 32. La actividad específica máxima de PA fue de 781 U g-1 cuando se utilizó 5 g L-1 de lactosa de suero de leche y 3 % de OD. Los resultados obtenidos mostraron que el jugo de Agave y el suero de leche pueden ser utilizados como fuente de carbono, para la producción de proteínas de interés comercial en procesos biotecnológicos, tal como rhIL-2, INF-g y PA. Por otra parte, se evaluó el transporte de interferón-g humano (hINF-g) e interleucina-2 humana (hIL-2) al periplasma de E. coli por la vía de secreción Tat. Para esto, los genes sintéticos de hINF-g y hIL-2 fueron fusionados al péptido señal de la penicilino acilasa modificado (SPpac), y clonados en los sitios HindIII y BamHI del vector de expresión pEMR. La expresión se llevó acabo en E. coli BL21-SI y las fracciones del periplasma, soluble e insoluble, se analizaron por Western blot. Se encontró rhINF-g soluble en el periplasma, mientras que rhIL-2 fue parcialmente procesada en el citoplasma. Con base en los resultados anteriores se concluyó que el plásmido pEMR permite transportar rhINF-g por la vía de secreción Tat."

"In this work, we present the use of the Gram negative bacteria Escherichia coli for the expression of recombinant proteins of biotechnology interest, using inexpensive carbon sources, such as fructose from Agave juice and lactose from cheese whey. The cytoplasmic production of human interleukin-2 (rhIL-2) from E. coli BL21-SI was 45 mg L-1 at 9 % dissolved oxygen (DO) and 10 g L-1 of fructose from Agave juice. In order to evaluate the effect of DO and lactose (from cheese whey) concentration on penicillin acylase production in E. coli W3110/pPA102, a design factorial 32 was used. Maximun specific PA activity was 781 U g-1 at 3 % of DO and 5 g L-1 of lactose from cheese whey. These result showed that Agave juice and cheese whey could be used as carbon source for the production of recombinant proteins with biotechnological interest, such as rhIL-2, INF-g and PA. In addition, the transport of human interferon-g (hINF-g) and human interleukin-2 (hIL-2) to periplasm of E. coli by Tat pathway was evaluated. The pEMR vector containing the T7 promoter and a modified signal peptide from penicillin amidase (SPpac), was used to express hINF-g and hIL-2 synthetic genes. HindIII and BamHI were used to clone in pEMR. The expression analysis was made in E. coli BL21-SI, periplasm, soluble and insoluble fractions, were analyzed by Western blot, we found that rhINF-g was produced as a soluble form in the periplasm, whereas rhIL-2 was partially processed in the cytoplasm. Based on these results the plasmid pEMR, presents an alternative for easy cloning and Sppac fusion in order to target gene products to the periplasm through the Tat pathway."