Growth of Trichoderma atroviride and importance of the nano-motor Kinesin-1 in its development

Abstract

"The vegetative growth of filamentous fungi comprises cell elongation and branching. This complex process involves Intracellular transport of molecules, vesicles and organelles within the cell interior, assisted by motor proteins, which, under the study of Nanosciences, are considered the smallest motors. Here, the growth process of Trichoderma atroviride was studied. First, a novel tool for automated tracking of growth in fungal cells (called hyphae) is introduced. This tool allows performing quantitative analysis of growth rate and morphology. An image-processing routine that detects in real-time the tip of a hypha and tracks it as the hypha elongates was developed. Tracking records allowed to determine that T. atroviride hyphae grow with characteristic elongation rates of ~ 0.07 μm/s. Prior to the occurrence of an apical branching event the parental hypha stopped growing during a few minutes. From tracking data, it was found that the persistence length (a measure of filament extension before presenting a change in direction) associated to T. atroviride hyphae is 362 μm. Second, the absence of Kinesin-1, one of the main nano-motors transporters of essential growth vesicles (reported for other filamentous fungi), and how it affects hyphal elongation, branching and morphology of T. atroviride was studied. By developing a Kinesin-1 deletion mutant strain it was shown that T. atroviride elongation rate drops up to ~ 60%, while branching highly increases. Several experiments following T. atroviride growth stages were carried out (germination, vegetative growth and conidiation) and determined that: The absence of Kinesin-1 modifies T. atroviride germination resulting in delayed conidia germination times. Also, about 50% of conidia presented bipolar germination. Vegetative growth was highly reduced with characteristic elongation rates of ~ 0.03 μm/s. Conidiation was also reduced in ΔKinesin-1 producing ~30x108 conidia vs ~8x108 WT. Altogether, these preliminary results show how integration of image analysis and computer control enable quantitative microscopic observations of fungal hyphae dynamics and how the absence of the nano-motor protein Kinesin-1 results in severe modifications of hyphal elongation, branching, conidiation and morphology."

"El crecimiento vegetativo de los hongos filamentosos se define por el alargamiento y la ramificación celular. Este crecimiento es un proceso complejo que involucra el transporte intracelular de moléculas, vesículas y organelos, mediado principalmente por nano-motores. En este proyecto, se estudió el proceso de crecimiento de Trichoderma atroviride en dos aspectos principales: Primero, se presenta una herramienta para el seguimiento automático del crecimiento de células de hongos filamentosos (llamadas hifas) para realizar un análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento y aspectos de su morfología. Se desarrolló una rutina de procesamiento de imágenes que detecta en tiempo real la punta de una hifa y la rastrea a medida que la hifa se alarga. Los registros de seguimiento permitieron determinar que las hifas de T. atroviride crecen con tasas de elongación características de ~ 0.07 μm / s. Se encontró que antes de que ocurriera un evento de ramificación apical, la hifa parental detiene su crecimiento durante unos minutos. Finalmente, se determinó que la longitud de persistencia (una medida de la extensión del filamento antes de presentar un cambio en la dirección) asociada a las hifas de T. atroviride es de 362 μm. Segundo, se estudió que la ausencia de la Cinesina-1, uno de los principales nano-motores transportadores de vesículas de crecimiento esenciales (reportados para otros hongos filamentosos), afecta la elongación de las hifas, la ramificación y la morfología de T. atroviride. Al desarrollar en el laboratorio una cepa mutante ΔCinesina-1, se observó que la tasa de elongación de T. atroviride disminuye hasta en un 60%, mientras que la ramificación aumenta considerablemente. Se llevaron a cabo varios experimentos morfológicos siguiendo las etapas de crecimiento de T. atroviride (germinación, crecimiento vegetativo y conidiación) y se encontró que: la ausencia de la Cinesina-1 afectó la germinación de T. atroviride dando como resultado que el ~ 50% de los conidios presentan germinación bipolar. El crecimiento vegetativo se vió altamente disminuido con tasas de elongación características de ~ 0.03 μm/s. El proceso de conidiación también se vió afectado en la cepa ΔCinesina-1 produciendo ~ 30x108 conidias vs ~ 8x108 en la cepa silvestre. En conjunto, estos resultados preliminares muestran cómo la integración del análisis de imágenes y el control por computadora permiten realizar observaciones microscópicas cuantitativas de la dinámica de las hifas de los hongos y cómo la ausencia de la proteína nano-motora Cinesina-1 produce modificaciones en la elongación de hifas, la ramificación, la conidiación y la morfología."