Identificación de ligandos y posibles compuestos guía para la proteína FABP4, mediante análisis de interacción por fluorescencia y cristalografía de proteínas.

Abstract

"La proteína 4 de unión a ácidos grasos (FABP4, de sus siglas en inglés) juega un papel importante en la regulación de las vías metabólicas relacionadas a glucosa y lípidos, así como en las vías de señalización asociadas a inflamación. Al inhibir a la proteína o eliminar el gen, se genera protección y mejoría en afecciones relacionadas a obesidad como diabetes, hipertensión, aterosclerosis y enfermedades cardiacas, por lo que hay gran interés en el desarrollo de un fármaco inhibidor de esta proteína. Aunque, la gran similitud estructural que tiene FABP4 con los otros miembros de la familia de proteínas FABP dificulta el diseño de un fármaco específico que no tenga reacción cruzada. El objetivo central de este trabajo fue la estandarización de la estrategia que se utilizará para buscar sitios de unión a ligandos en FABP4 por cristalografía de rayos-X. En este trabajo expresamos a FABP4 en la cepa BL21 (DE3) Star de Escherichia coli y la purificamos en 3 pasos: por afinidad a Níquel, intercambio iónico y exclusión molecular; logrando un rendimiento de 7mg/L de proteína. Se seleccionaron 20 compuestos de la planta medicinal Salvia amarissima por su similitud química a inhibidores ya reportados de FABP4. Se evaluó la unión de los compuestos a FABP4 por un ensayo de competencia con ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico (1,8-ANS), que permitió determinar la concentración necesaria para obtener una inhibición del 50% (IC50) para cada uno de los compuestos, y el ibuprofeno se utilizó como control positivo, debido a que en un trabajo previo se describió al ibuprofeno como un posible inhibidor de FABP4. Los compuestos 2, 3, 4 y 5 son los compuestos con mejor afinidad respecto a los 20 evaluados, siendo el compuesto 3 el que se une mejor por mostrar un IC50 menor al resto (189.3 ± 15.3µM). Conseguimos la cristalización de la proteína FABP4 sin ligando. Mediante el método de “soaking” a 2 h y 8 h, se obtuvieron cristales del complejo FABP4/ibuprofeno los cuales fueron difractados. Actualmente contamos con los datos de los cristales de FABP4 con 4-iodopirazol y 4-bromopirazol obtenidos por “soaking” a 2h y 8h para procesarlos. Sin embargo, con este método no se logró visualizar la presencia de los compuestos de S. amarissima. Como alternativa, realizamos experimentos de co-cristalización con los compuestos 2, 4, 5 y 6, quedando pendiente el compuesto 3, con un resultado positivo. Por lo tanto, en este trabajo mostramos las estructuras FABP4 sin ligando y FABP4/Ibuprofeno resueltas por reemplazo molecular y refinadas mediante los programas de la plataforma PHENIX y el programa Coot."

"Fatty acid-binding protein 4 (FABP4) plays an important role in the regulation of glucose and lipid-related metabolic pathways, as well as signaling pathways associated with inflammation. By inhibiting the protein or removing the gene, protection and improvement is generated in obesity-related conditions such as diabetes, hypertension, atherosclerosis, and heart disease, so there is great interest in developing a drug that inhibits this protein. However, the great structural similarity that FABP4 has with the other members of the FABP family of proteins makes it difficult to design a specific drug that does not cross react. The central objective of this work was the standardization of the strategy that will be used to search sites to ligands in FABP4 by X-ray crystallography. In this work we show the expression of FABP4, in the BL21 (DE3) Star cells of Escherichia coli and the purification in 3 steps: by nickel affinity, ion exchange and molecular exclusion; achieving a yield of 7mg/L of protein. Twenty compounds of Salvia amarissima were selected for their chemical similarity to already reported FABP4 inhibitors. The binding of the compounds to FABP4 was evaluated by a competitive displacement assay with 1- anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS), which allowed to determine the concentration required to obtain a 50% inhibition (IC50) for each one. We used ibuprofen as a positive control, since in a previous work ibuprofen has been described as a possible FABP4 inhibitor. Compounds 2, 3, 4 and 5 are the compounds with the best affinity with respect to the 20 evaluated, being compound 3 the one that binds better because it shows an IC50 lower than the rest (189.3 ± 15.3 μM). We achieved the crystallization of the FABP4 protein without ligand. By means of the soaking method at 2h and 8h, crystals of the FABP4/ibuprofen complex were obtained and diffracted. Currently we have the data to process of FABP4 crystals with 4-iodopyrazole and 4-bromopyrazole obtained by soaking at 2h and 8h. However, with this method we were not able to visualize the presence of Salvia amarissima compounds. As an alternative, we performed co-crystallization experiments with compounds 2, 4, 5 and 6, with compound 3 remain to be done. Crystallization was successful, and diffraction experiments will be performed shortly. Therefore, in this work we show the FABP4 unbound and FABP4/Ibuprofen structures solved by molecular replacement and refined by the PHENIX and Coot programs."