Determinación experimental del código de unión específica al ADN de proteínas iniciadoras de la replicación de geminivirus

Abstract

"Los geminivirus constituyen la familia más extensa de virus de plantas; poseen un genoma circular de DNA de cadena sencilla (ssDNA) y codifican una proteína iniciadora de la Replicación por Círculo Rodante (RCR), denominada “Rep”. Estas proteínas reconocen y unen con alta afinidad elementos cortos repetidos, denominados “iterones”, que se ubican en el origen de replicación viral. En los geminivirus se han descrito decenas de iterones diferentes, y existe un evidente interés por comprender el código molecular que determina la preferencia de Rep por iterones específicos. Mediante una combinación de enfoques teóricos y experimentales, nuestro grupo ha logrado identificar cinco potenciales Determinantes de Especificidad (DEs), esto es, residuos aminoacídicos que podrían determinar la preferencia de Rep por secuencias de DNA específicas. En el caso del geminivirus bipartita ToMoV (virus del moteado del tomate) esos cinco residuos de Rep se ubican en las posiciones 5, 8, 10, 69 y 71. El objetivo del presente estudio fue examinar experimentalmente la hipótesis antes mencionada. A partir de un modelo predictivo de presuntos pares cognados RepDEs-Iterón se construyeron 8 componentes genómicos A (DNA-As) de ToMoV con mutaciones en los codones de los DEs hipotéticos. Estos DNA-As mutantes fueron examinados en ensayos de auto-replicación transitoria en protoplastos de tabaco NT1. Los DNA-A mutantes se replicaron a niveles muy inferiores al virus silvestre, y en algunos casos no se detectó DNA viral de novo, lo que sugiere que las proteínas con mutaciones en los residuos 5, 8, 10, 69 y 71, perdieron, parcial o totalmente, la capacidad de unirse a los iterones nativos de ToMoV. En una segunda fase, generamos DNA-As en los que los iterones de ToMoV fueron sustituídos por los presuntos sitios de unión de las proteínas Rep mutantes. Se evalúo la capacidad replicativa de cinco de esos DNA-As “doblemente mutados” de ToMoV, mediante ensayos de auto-replicación en discos de hoja, observándose la generación de DNA viral de novo, lo que indica que las proteínas Rep mutadas reconocieron a los iterones predichos por el modelo hipotético. Finalmente, se generaron componentes B mutantes, en los que los iterones de ToMoV fueron sustituídos por iterones idénticos a los correspondientes a los DNA-As mutantes, y se realizaron ensayos de agroinoculación de plantas de N. benthamiana, usando clonas infectivas de cinco de los componentes genómicos A y B mutantes. Las plantas inoculadas presentaron síntomas visibles a partir del día 14 post-inoculación (dpi). Se extrajo DNA total de las hojas nuevas de 3 plantas de cada grupo experimental, y se amplificaron los segmentos con el origen de replicación y parte del gen Rep con iniciadores específicos. La secuenciación de los productos de PCR confirmó que los DNA virales en las plantas sintomáticas correspondían a los componentes A y B mutantes que fueron inoculados. Estas observaciones apoyan fuertemente la hipótesis general propuesta, y contribuyen de modo significativo al desciframiento del código que determina el reconocimiento específico de los iterones por las proteínas Rep de geminivirus."

"The family Geminiviridae is the largest and ecologically most succesful family of plant viruses, Its genomes consist of one or two small, circular ssDNA molecules encoding a few multifunctional proteins, including a rolling-circle replication (RCR) initiation protein, termed Rep, that shares several conserved amino acid sequence motifs with many other viral and plasmidic RCR proteins. The Rep protein recognize and bind with high-affinity short repeat DNA sequences, denominated “iterons”, which are sited close to the geminiviral origin of replication. Dozens of different iterons have been described; consequently, exists a natural interest for knowing the molecular code that ruled of preference of Rep by specific iterons. Through a combination of theoretical and experimental approaches, our group has been able to (tentatively) identify a series of amino acid residues in the geminivirus Rep that probably determine its preference for specific iterons. We have identified five major potential Specificity Determinants (SDs) of the Rep DNA- binding domain, that is, aa residues that could determine the Rep preference for specific iterons. In the case of the bipartite geminivirus ToMoV (tomato mottle virus) those five residues have been mapped at positions 5, 8, 10, 69, and 71 of Rep. The aim of this study was validated the aforesaid hypothesis. Based on a predictive model of postulated RepDEs-Iterón cognate pairs, 8 genomic components A (DNA-As) of ToMoV were constructed displaying mutations at the hypothetical DEs codons. These mutant DNA-As were examined in transient self- replication assays in tobacco protoplasts NT1. The mutant A-DNAs replicated at much more lower levels than wild-type viruses, hence suggesting that the mutated Rep partially or totally, lost the ability to bind the native ToMoV iterons. In a second phase, we generated DNA-As in which the ToMoV iterons were replaced by the putative binding sites of the mutant Rep proteins. The replicative capacity of five of these ToMoV-A “double mutants” was evaluated in self-replication assays on leaf discs. As a result, the generation of de novo viral DNA was observed, although the variability between independent agroinoculation assays was elevated. Finally, mutant B components were generated, in which the iterons of ToMoV-B were replaced by iterons identical to those corresponding to the mutant DNA-As, and were evaluated by agroinoculation assays of N. benthamiana plants, using infective clones of five of the mutant genomic components A and B. The inoculated plants presented visible symptoms at 14 days post-inoculation (dpi). Total DNA was extracted from the new leaves of plants of each experimental group and the segments with the origin of replication and part of the Rep gene were amplified with specific primers. The sequencing of the PCR products confirmed that viral DNAs in symptomatic plants corresponded to the mutant components A and B that were inoculated. These observations strongly support the proposed general hypothesis and contribute significantly to deciphering the code determining the specific recognition of iterons by geminivirus Rep proteins."