PCR en tiempo real anidad para cuantificar los genes E6 y E7 del virus del papiloma humano tipo 16.

Abstract

"El cáncer cervicouterino (CaCu) es la segunda causa de muerte por cáncer entre las mujeres del mundo y la primera en la mayoría de los países en desarrollo. En México mueren cada año cerca de 4,500 mujeres por CaCu. La infección persistente por virus del papiloma humano (VPH) de “alto riesgo”, principalmente por el VPH tipo 16 (VPH16) es uno de los principales factores de riesgo para la progresión de las lesiones neoplásicas, aunque no todas las mujeres infectadas con VPH-AR desarrollan cáncer. La integración del genoma viral con deleción parcial del gen viral E2 parece determinante en la progresión hacia el cáncer cervical invasor. La prueba primaria de tamizaje del CaCu es el análisis citológico (Papanicolaou), de sensibilidad y especificidad limitadas para evaluar la progresión de las lesiones neoplásicas, por lo cual es deseable desarrollar marcadores moleculares más objetivos de la progresión neoplásica. Un marcador molecular propuesto es la carga viral (número de copias de genes virales); otro es la integración del genoma viral mediante cuantificación del gen viral regulador E2 y de los oncogenes E6 y E7 para calcular los cosientes E2/E6 y E2/E7, cuyos valores tienden a cero en el estado de integración pura. La mayoría de los estudios de integración se han realizado con PCR en tiempo real (qPCR) de los genes E2 y E6 en presencia del fluorocromo SYBRGreen. En nuestro laboratorio fue desarrollado recientemente un método de qPCR anidada ultrasensible para E6 y E2 con EvaGreen como fluorocromo. MÉTODOS. La estrategia de este trabajo incluyó la generación de las construcciones control pPC301 y pCA401, con los insertos de los genes E6 y E7 de 339 y 252 pares de bases (E6-339 y E7-252) respectivamente, amplificados a partir del genoma de VPH16 y ligados en el vector de clonación pCR4-TOPO, con los cuales obtuvimos transformantes de Escherichia coli TOP10 cuyos plásmidos purificamos."

"Cervical cancer (CC) is the second cause of death by cancer among women worldwide and the first one in most developing countries. In Mexico around 4,500 women die each year by CC. Persistent infection with "high risk" human papillomavirus (HRHPV), mostly of the HPV type 16 (HPV16), is one of the major risk factors for the progression of precancerous and cancerous lesions, although not all infected women develop cancer. Integration of the viral genome with partial deletion of the viral E2 gene appears to be a decisive event in the progression to invasive CC. Since the Pap smear (Papanicolaou), primary screening test for CC, is known to have limited sensitivity and specificity to evaluate the progression of neoplastic lesions, it is desirable to develop more objective molecular markers of progression. A proposed molecular marker is the viral load (number of viral genes copies); another one is the integration of the viral genome estimated through quantitation of the viral E2 repressor and the E6 and E7 oncogene sequencies to calculate the E2/E6 and E2/E7 ratios, whose values approach zero in the state of pure integration. Most integration studies have been performed using real-time PCR (qPCR) of the E2 and E6 genes in the presence of the SYBRGreen intercalating fluorochrome. In our laboratory an ultrasensitive nested qPCR method for E6 and E2 was developed recently using EvaGreen as fluorochrome. METHODS. Our strategy for this work included the generation of the pPC301 and pCA401 control constructs with E6- and E7-HPV16 inserts of 339 and 252 base pairs (E6-339 and E7-252) respectively, ligated to the pCR4-TOPO cloning vector, with which we obtained Escherichia coli TOP10 transformants and purified their plasmids. Nested qPCR calibration was carried out in two steps: 1) preamplification of the E6-339 or E7-252 amplicons for 15 cycles by end-point PCR using serial logarithmic dilutions of the control constructs (104-107 pCA401 or pPC301 molecules per mixture), and 2) nested qPCR of the E6-152 and E7-170 internal amplicons in mixtures containing 1/50 volume from each preamplified mixture to generate the type curves and to determine the thermal denaturation profiles of the nested amplicons."