Construcción de un vector para clonar productos de PCR

Abstract

"Los vectores-T se usan para clonar productos de PCR. Estos contienen extremos 3´T en donde se clonan directamente los productos de PCR debido a que la Taq polimerasa añade con preferencia residuos A en los extremos 3´ de estos productos de PCR. Todos los plásmidos deben contener al menos un marcador de selección para identificar las clonas. Algunos tienen marcadores de contraselección que, bajo condiciones apropiadas de crecimiento, promueven la lisis de los microorganismos que los contienen. Uno de los marcadores de contraselección mas usados es el gen que confiere sensibilidad a sacarosa: sacB de Bacillus subtilis. La expresión de sacB en E. coli es letal, en presencia de sacarosa. Sin embargo, si sacB es interrumpido por la inserción de un producto de PCR, las transformantes son viables. El uso de sacB como marcador de selección es una mejora sobre la estrategia convencional de clonación T/A porque elimina la necesidad del escrutinio de color azul/blanco basado en la complementación alfa. En este trabajo desarrollamos un vector-T (pMB11) para clonar productos de PCR en forma eficiente y se basa en la selección de clonas positivas, de fácil y rápido manejo y reduciendo considerablemente los costos. Proponemos el uso de este vector como una alternativa de clonación de productos de PCR para no depender de los vectores comerciales. pMB11 contiene a sacB como marcador de contraselección para clonas positivas, confiere resistencia a cloranfenicol (cat) y su origen de replicación es de un número intermedio de copias. Demostramos que la adición de extremos 3´T en el pMB11 fue eficiente y que el plásmido puede clonar productos de PCR también con una alta eficiencia. Además caracterizamos la respuesta al estrés oxidativo de Candida glabrata para entender mejor su virulencia. C. glabrata resiste concentraciones mas altas de H2O2 que Saccharomyces cerevisiae y que Candida albicans. En fase estacionaria es extremadamente resistente a H2O2 y su resistencia depende de Yap1p, Skn7p, y Msn4p. Las células en crecimiento de C. glabrata se adaptan a niveles altos de H2O2 y su respuesta adaptativa depende de Yap1p y Skn7p principalmente. C. glabrata tiene un solo gen de catalasa, CTA1, que es absolutamente necesario para la resistencia a H2O2 in vitro. Sin embargo, en un modelo de infección sistémica en ratón, la cepa carente de CTA1 no mostró efectos en virulencia."

"T-vectors are used to clone efficiently PCR fragments generated by Taq polymerase which preferentially adds an A residue to the 3´ end of the PCR products. These vectors contain 3´T overhangs and PCR products can be cloned directly. Almost all T-vectors use the white/blue screen based on lacZ alphacomplementation to identify positive clones. Alternatively, some vectors use a counterselectable marker to select the positive clones. This counterselectable marker under appropiate growth conditions, prevents the cells from growing. One of the most widely used counterselectable markers is Bacillus subtilis sacB gene which confers sucrose sensitivity. E. coli cells expressing sacB cannot grow in the presence of sucrose. However, if sacB is interrupted by an insertion of a PCR product, then E. coli cells can grow in the presence of sucrose. The important diffrence between conventional T/A cloning and counterseletion is selection versusscreening of the positive clones. The use of sacB eliminates the white/blue screen. In the present study, we disigned a T-vector (pMB11) to clone efficiently PCR products, based on sucrose counterselection of positive clones. Plasmid preparation and cloning is easy and fast and is less expensive than the commercial T-vectors currently available from biotech companies. pMB11 contains the sacB gene as the counterselectable marker, cat gene for chloramphenicol resistance and the p15A orgin of replication of intermediate copy number. We showed that the addition of 3´T in pMB11 is efficient and that the plasmid can be used to efficiently clone PCR products. We propose the use of this vector as an alternative to the commercialy available T/A vectors. We characterized the oxidative stress response of Candida glabrata to better understand its virulence. C. glabrata could withstand higher concentrations of H2O2 than Saccharomyces cerevisiae and even Candida albicans. Stationaryphase cells were extremely resistant to H2O2, and this resistance was dependent on the concerted roles of stress-related transcription factors Yap1p, Skn7p, and Msn4p. We showed that growing cells of C. glabrata were able to adapt to high levels of H2O2 and that this adaptive response was dependent on Yap1p and Skn7p and partially on the general stress transcription factors Msn2p and Msn4p. C. glabrata has a single catalase gene, CTA1, which was absolutely required for resistance to H2O2 in vitro. However, in a mouse model of systemic infection, a strain lacking CTA1"