Medición de la procesividad de la cinesina-1 DmK401 mediante videomicroscopía

Abstract

"La cinesina-1 es una proteína motora que une cargamentos (organelos o complejos moleculares) y los transporta a pasos hacia el extremo más de los microtúbulos, en un proceso que implica ciclos sucesivos de hidrólisis del nucleótido adenosina trifosfato. Una vez que la cinesina tiene un encuentro con un microtúbulo efectúa, en promedio, 100 pasos de 8 nm antes de disociarse por completo. Esta propiedad es conocida como procesividad, y es de ≈800 nm para una única molécula de cinesina-1, in vitro. Sin embargo, debido a que en las células los cargamentos son transportados por grupos de una a siete proteínas motoras, es importante estudiar el transporte efectuado por más de un motor. El objetivo del presente trabajo es determinar la procesividad in vitro de la cinesina-1 DmK401 cuando hay una o más de una molécula de cinesina transportando el mismo cargamento, mediante el seguimiento del cargamento por videomicroscopía. Como cargamento utilizamos microesferas de poliestireno que incubamos con dos diferentes diluciones de cinesina; así obtenemos de manera controlada una o más de una molécula motora por esfera. Para conocer la procesividad de la cinesina atrapamos esferas individuales con una pinza óptica, las colocamos sobre un microtúbulo y esperamos a que se presente movimiento dirigido. Inmediatamente después del inicio del transporte dirigido obturamos la pinza óptica, permitiendo que el motor se desplace libremente sobre el microtúbulo. Cada uno de estos eventos se registró en un video. Los videos se analizaron en computadora mediante un programa escrito en el software LabVIEW que, mediante el seguimiento automatizado de la posición de la esfera, nos proporcionó la distancia recorrida por la cinesina. La procesividad de una molécula de cinesina-1 DmK401 medida en este trabajo es de 500 nm, la velocidad de 650 nm*s-1. Además, observamos que cuando un cargamento tenía más de una cinesina ocurrían eventos en que las distancias recorridas eran ≥ 7 μm. Conocer esta propiedad es esencial, porque nos permitirá determinar cómo se modifica la longitud de avance cuando la cinesina transporte su cargamento en un contexto más complejo y cercano al celular como, por ejemplo, dentro de una red tridimensional de microtúbulos."

"Kinesin-1 is a motor protein that binds and transports cargoes (organelle or molecular complexes) by stepping on microtubules towards the plus end. This process requires successive cycles of adenosine triphosphate hydrolysis. Kinesin takes, on the average, 100 steps of 8 nm per encounter with a microtubule. This property is called processivity and its value is 800 nm for a single kinesin-1 molecule, in vitro. However, because in cells cargoes are transported by groups of proteins (ranging from one to seven), it is important to investigate transport by more than one motor. Our goal is to determine kinesin-1 DmK401 processivity in vitro, when one or more than one motor molecule transports the same cargo, by tracking cargoes using video microscopy. As cargo we used polystyrene microbeads that we incubated with two different kinesin dilutions. To measure processivity, we trap individual beads with optical tweezers and bring them in contact with a microtubule, after which we wait for the bead to show directed motion. Immediately after directed movement begins we shutter the laser beam, allowing for free motor stepping on the microtubule without load. Each event was registered in a video. Videos were analyzed with a LabVIEW program that automatically follows the bead position, from where we determine the distance traveled by kinesin. The measured processivity of single DmK401 molecules is 500 nm, the velocity is 650 nm*s-1. When a bead had more than one kinesin molecule we noted cargoesreach distances ≥ 7 μm. Our measurements of DmK401 processivity are essential for us because we want to study cargo transport in a more complex enviroment, as, for example, in a three-dimensional microtubule network."