Clonación, sobre-expresión y purificación de las proteínas NSP5 y NSP6 de rotavirus en Escherichia coli

Abstract

"Los rotavirus representan una de las principales causas de gastroenteritis entre los niños menores de cinco años a nivel mundial. Son virus icosaédricos no envueltos que pertenecen a la familia Reoviridae. Cada segmento de su genoma de ácido ribonucléico de cadena doble (ARNcd) codifica para una proteína estructural (VP) o no estructural (NSP) con excepción del segmento 11 que codifica para dos proteínas (NSP5 y NSP6). NSP5 es una fosfoproteína implicada en la formación de viroplasmas así como en la regulación del equilibrio traducción/replicación de ácido ribonucléico mensajero (ARNm) viral. NSP6 podría tener una función regulatoria sobre NSP5. Sin embargo, no se ha reportado información estructural o funcional de las proteínas NSP5 y NSP6. El principal objetivo del presente trabajo fue la sobreexpresión y purificación de las proteínas NSP5 y NSP6 de rotavirus en Escherichia coli. Se utilizaron distintos sistemas de expresión: 1) fusión a 6XHis en el extremo C-terminal, y 2) fusión a GST en el extremo N-terminal. La fusión con 6XHis produjo 2% de proteína total de NSP5 y 11% de NSP6. En contraste, las proteínas GST-NSP5 y GST-NSP6 corresponden al 34 y 31% de las proteínas totales, respectivamente. Las fusiones con GST parecen tener un efecto de protección contra la toxicidad de la proteínas no estructurales de rotavirus en Escherichia coli. En ambos sistemas, las proteínas recombinantes se encontraron almacendas como cuerpos de inclusión. Se determinaron las condiciones para la solubilización y purificación de las proteínas heterólogas y se obtuvieron cantidades adecuadas para la realización de análisis funcionales y ensayos de cristalización."

"Rotavirus is one of the worldwide leading causes of gastroenteritis in children under five years of age. They are icosahedral non-coated viruses that belong to Reoviridae family. Each segment of their double stranded ribonucleic acid (dsRNA) genome codes for a structural (VP) or nonstructural (NSP) protein, except the 11 segment that codes for two proteins: NSP5 and NSP6. NSP5 is a phosphoprotein involved in the viroplasms formation, as well as in the viral messenger ribonucleic acid (mRNA) translation/replication-regulation. NSP6 could have a regulatory function over NSP5. However, there is no information about the NSP5 and NSP6 structure of rotavirus proteins. The present work had the main objective the overexpression and purification of the NSP5 and NSP6 rotavirus proteins in Escherichia coli. Different plasmids were used: 1) the fusion to His-tag in the Cterminus, and 2) the fusion to GST to the N-terminus. NSP5-His-tag fusion was produced in only 2% of total protein; NSP6 was expressed in higher amounts (11% of total protein). In contrast, the GST-NSP5 and GST-NSP6 fusion proteins were about 34% and 31% of total protein content, respectively. GST fusions could have a protective effect against the toxicity of the rotaviral non-structural proteins overexpressed in Escherichia coli; however, in both systems, the recombinant proteins NSP5 and NSP6 were recovered as inclusion bodies. We have found the conditions for the solubilization and purification of the heterologous proteins. Amounts of the recombinant proteins were enough to perform functional studies and crystallization assays."