Caracterización funcional de una dehidrina SK3 aislada de una biblioteca de cDNA de Opuntia streptacantha

Abstract

"En este trabajo de tesis analizamos al nopal con un enfoque fisiológico y uno molecular. La primera etapa consistió en analizar el efecto de poliaminas y prolina en la germinación de semillas de nopal (Opuntia streptacantha) sometidas a estrés salino. Los resultados mostraron tendencias a un porcentaje de germinación mayor en comparación al control en semillas de nopal tratadas con prolina 1 mM. En los tratamientos de poliaminas exógenas, no se observó un efecto en el rompimiento de la latencia de las semillas. Por otro lado el estrés salino afectó la germinación de las semillas de nopal, sobretodo a las concentraciones de NaCl de 50 y 75 mM. En los tratamientos donde aplicamos tanto prolina (1 y 10 mM) como poliaminas (1μM de cada una), solo el tratamiento con espermina logró obtener una recuperación en el porcentaje de germinación al someter las semillas a una concentración de NaCl de 75 mM . En la segunda etapa se aislaron, identificaron y caracterizaron genes de nopal inducidos durante estrés abiótico. Para ello se construyó una biblioteca de cDNA de cladodios de nopal sometidos a diferentes tipos de estrés: sequía, salinidad, calor y frío. De esta biblioteca se obtuvieron 329 unigenes a partir de 442 clonas seleccionadas al azar incluyendo genes que codifican proteínas LEA (Late Embryogenesis Abundant), ERD15 (Early responsive to the Dehydration 15), HSP (Heat Shock Protein), AQPs (aquaporins), entre otros. Se seleccionó el EST más abundante de la biblioteca, el unigen 33 (OpsDHN1), que codifica una dehidrina del tipo SK3 de 248 aminoácidos, para su caracterización molecular y funcional. Además del cDNA se obtuvo un fragmento de DNA genómico del gen OpsDHN1, el cual tiene un intrón de 234 pb interrumpiendo el marco de lectura abierto de este gen. La expresión del gen OpsDHN1 se analizó mediante RT-PCR en tiempo real a partir de muestras de cladodios sometidos a estrés, mostrando que el trancrito de OpsDHN1 se acumula en respuesta a estrés por frío y por ABA. Por otro lado, se generaron líneas transgénicas de A. thaliana que sobreexpresan el gen OpsDHN1 de nopal, las cuales tuvieron una mayor tasa de sobrevivencia en comparación al control después de la recuperación de un estrés por congelamiento, mientras que bajo estrés salino, no se observaron diferencias en la tasa de sobrevivencia entre las líneas sobreexpresantes y la parental (Col-0). Con esta evidencia se sugiere que la dehidrina de nopal (OpsDHN1) puede estar involucrada en los mecanismos de respuesta al estrés por congelamiento. La información obtenida en esta tesis, que incluye el aislamiento e identificación de genes de nopal en respuesta a estrés abiótico, y la caracterización de uno de ellos, constituye una plataforma inicial para el estudio de genes en Opuntia spp. y la generación de una base de secuencias de nopal y posibles aplicaciones para conferir tolerancia a estrés abiótico a otras especies vegetales."

"In this work we analyzed the cactus pear with a physiological and a molecular approach. The first part of this work was to analyze the effect of polyamines and proline in the germination of seeds of cactus pear (Opuntia streptacantha) under salt stress. The results showed trends to higher germination percentage compared to the control of cactus pear seeds treated with 1 mM proline. In the treatment of exogenous polyamines, there was no effect in breaking seed dormancy. On the other hand, salt stress affected the germination of seeds of cactus, especially at concentrations of 50 and 75 mM NaCl. In the treatments in which both proline (1 and 10 mM) and polyamines (1μM each one) were applied, only treatment with spermine was able to recover the percentage of seeds at 75 mM NaCl. In the second part of this work, cactus pear genes expressed under abiotic stress were isolated and characterized. We constructed a cDNA library of cactus pear cladodes under different types of stress: drought, salinity, heat and cold. From this library 329 unigenes were obtained from 442 randomly selected clones including genes that encode LEA proteins (Late Embryogenesis Abundant), ERD15 (Early Responsive to the Dehydration 15), HSP (Heat Shock Protein), AQPs (aquaporins), among others. We selected the most abundant EST library, unigen 33 (OpsDHN1), which encodes a SK3-type dehydrin of 248 amino acids for molecular and functional characterization. In addition to the cDNA sequences, a genomic DNA fragment of the OpsDHN1 gene was obtained, which has an intron of 234 bp interrupting the open reading frame of this gene. qRT-PCR analysis showed that the OpsDHN1 transcript is specifically accumulated in response to cold, and induced by ABA. On the other hand, we generated transgenic lines of A. thaliana overexpressing the OpsDHN1 gene of cactus pear. These lines had ahigher survival rate compared to the control after recovery from freezing stress, whereas under salt stress, there was no difference in survival rate between the transgenic lines and parental (Col-0). This evidence suggests that the dehydrin of cactus pear (OpsDHN1) might be involved in freezing stress responsiveness."