Caracterización bioquímica y estructural de un homólogo de XanA de Aspergillus nidulans

Abstract

"La enzima XanA de Aspergillus nidulans de reciente descubrimiento, cataliza la conversión de xantina a ácido úrico como una ruta alternativa a la producción de ácido úrico en hongos. Es la primera enzima dependiente de α-cetoglutarato y Fe (II) que ha sido reportada que utiliza una purina libre como sustrato primario. Se considera exclusiva de hongos, hasta el momento ha sido poco estudiada y no se conoce su mecanismo de reacción ni estructura tridimensional. En el 2014, nuestro grupo de investigación, comenzó a trabajar con la enzima XanA de A. nidulans; sin embargo, no fue posible obtener un cristal de buena calidad que permitiera obtener un correcto patrón de difracción de rayos X. El objetivo central de este trabajo fue identificar y caracterizar una proteína homóloga a XanA de A. nidulans que presente características fisicoquímicas que le otorguen mayor probabilidad de éxito en el proceso de cristalización. Aquí mostramos tres secuencias homólogas a XanA de A. nidulans pertenecientes a los hongos Sclerotinia borealis, Eutypa lata y Aspergillus oryzae, las cuales nombramos como XanA_borealis, XanA_lata y XanA_oryzae, respectivamente. Estas secuencias se clonaron y expresaron como proteínas recombinantes en Escherichia coli. En este proyecto se decidió caracterizar bioquímica y estructuralmente la proteína XanA_oryzae. Se optimizó su purificación en tres pasos y obtuvimos un rendimiento final de 4.12 mg de proteína /L de cultivo. Además se determinó la Km de XanA_oryzae para α-cetoglutarato y xantina, y se propone que esta enzima presenta un “mecanismo secuencial bi bi ordenado”. También se realizaron varios ensayos de cristalización donde se obtuvó un posible cristal de XanA_oryzae en la condición que contiene 0.2 M acetato de zinc dihidratado, 0.1 M de cacodilato de sodio trihidratado pH 6.5 y 18 % p/v de polietilenglicol 8,000, como agente precipitante."

"The recently discovered XanA enzyme from Aspergillus nidulans catalyzes the conversion of xanthine to uric acid as an alternative route to the production of uric acid in fungi. It is the first α-ketoglutarate and Fe (II) -dependent enzyme that has been reported to utilize a free purine as the primary substrate. It is considered exclusive of fungi, up to now its reaction mechanism has been little studied and its three-dimensional structure is not known. In 2014 our research group began to work with the XanA enzyme of A. nidulans, however it was not possible to obtain a good quality crystal that would allow to obtain a correct X-ray diffraction pattern. The central aim of this work is to identify and to characterize an homologous to XanA of A. nidulans that presents physicochemical characteristics that give it greater probability of success in the process of crystallization. Here we report three sequences homologous to XanA of A. nidulans belonging to the organisms Sclerotinia borealis, Eutypa lata and Aspergillus oryzae; which we named as XanA_borealis, XanA_lata and XanA_oryzae respectively. These sequences were cloned and expressed as recombinant proteins in Escherichia coli. In this project it was decided to biochemically and structurally characterize the XanA_oryzae. Its purification was optimized in three steps, getting a final yield of 4.12 mg protein / L culture. In addition, the Km of XanA_oryzae for α-ketoglutarate and xanthine was determined and it is proposed that this enzyme has a "bi bi sequential mechanism". Several crystallization tests were also carried out where a possible crystal of XanA_oryzae was observed in the condition containing 0.2M zinc acetate dihydrate, 0.1M sodium cacodylate trihydrate pH 6.5 and 18% w / v polyethylene glycol 8,000, as a precipitating agent."