Detección de virus del papiloma humano 16, 18 y 33 mediante amplificación isotérmica de sondas padlock tipo-específicas para el oncogén E6

Abstract

"La infección persistente por virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo causa el cáncer cervicouterino (CaCu). Para identificar los tipos de VPH generalmente se emplea la reacción en cadena de la polimerasa. Los ensayos con sondas padlock (SP) --basados en amplificación por el mecanismo de círculo rodante (RCA)-- no requieren termociclador y podrían emplearse para tipificar VPH en el sitio de atención. Las SP son oligodesoxinucleótidos lineales con tres elementos: 1) brazo de anclaje en el extremo 5’, 2) brazo de extensión en el extremo 3’, y 3) elemento espaciador interno con una secuencia para un sitio de restricción generado en la sonda amplificada, de cadena doble. Cuando los brazos de anclaje y extensión hibridan con la secuencia blanco sus bordes yuxtapuestos pueden ser ligados enzimáticamente y las SP circularizadas de esta manera pueden ser amplificadas isotérmicamente como concatémeros lineales formados por monómeros de cadena doble en tándem. Nos propusimos desarrollar ensayos SP-RCA uniplex para detectar el oncogén E6 de los tipos de VPH de alto riesgo 16, 18 y 33, altamente prevalentes en CaCu, con sondas padlock tipo-específicas que pudieran combinarse en ensayos multiplex. Diseñamos tres sondas de diferente longitud con un sitio Bam HI en el elemento espaciador: SP-VPH16, de 96 nucleótidos (nt); SP-VPH18, de 114 nt; SP-VPH33, de 132 nt. Los ensayos SP-RCA se llevaron a cabo en seis pasos: 1) desnaturalización del ADN blanco a 95 °C, 2) hibridación de la sonda a la secuencia blanco a 65 °C, 3) ligación de la sonda hibridada a 25 °C, 4) amplificación de la sonda circularizada iniciada por hexanucleótidos aleatorios a 30 °C, 5) restricción de los concatémeros de cadena doble con Bam HI a 37 °C, y 6) análisis electroforético de los monómeros. El análisis in silico de homodímeros, heterodímeros y estructuras secundarias a 65 °C indicó que las sondas podrían detectar 33 variantes de VPH 16, 18 y 33. Obtuvimos monómeros de los tamaños esperados a partir de ensayos SP-RCA uniplex con plásmidos que portan genomas completos de los tres tipos virales y ADN de un raspado cervical con VPH 16. Concluimos que los ensayos SP-RCA uniplex podrían usarse para diagnosticar infecciones tipo-específicas por VPH en el sitio de atención. "

"Persistent infection with high-risk human papillomavirus (HPV) causes cervicouterine cancer (CC). The polymerase chain reaction is generally used to identify HPV types. Assays with padlock probes (PPs) --based on isothermal rolling circle amplification (RCA)-- do not require a thermocycler and might be used to typify HPV at the point of care. PPs are linear oligonucleotides with three elements: 1) anchorage arm at the 5’-end, 2) extension arm at the 3’-end, and 3) internal spacer element which includes a sequence for a restriction site generated in the doublestranded amplified probe. When the anchorage and extension arms hybridize to the target sequence their juxtaposed borders may be enzymatically linked, and the circularized PPs can be isothermally amplified as linear concatemers formed by double-stranded monomers arranged in tandem. Our aim was to develop uniplex PP-RCA assays to detect E6 oncogenes of the high-risk HPV types 16, 18 and 33, highly prevalent in CC, using type-specific probes that might be combined in multiplex assays. Three probes of different length that include a Bam HI restriction site in the spacer element were designed: PP-VPH16 of 96 nucleotides (nt); PP-VPH18 of 114 nt; PP-VPH33 of 132 nt. PP-RCA assays were carried out in six steps: 1) target DNA denaturation at 95 °C, 2) hybridization of the probes to the target sequence at 65 °C, 3) ligation of the hybridized probe at 25 °C, 4) amplification of the circularized probe primed by random hexanucleotides at 30 °C, 5) restriction of the double-stranded concatemers with Bam HI at 37 °C, and 6) electrophoretic analysis of the monomers. In silico analysis of homodimers, heterodimers and secondary structures formed at 65 °C indicated that the probes would detect 33 variants from HPV 16, 18 and 33. The expected monomers were obtained in uniplex PP-RCA assays with plasmids carrying complete genomes of the three viral types and with DNA from a cervical scrape with HPV 16. We conclude that the uniplex assays developed here might be used to diagnose HPV type-specific infections at the point of care."