Producción de las proteínas antiangiogénicas: vasostatina, vasoinhibina y sus quimeras en Escherichia coli y su actividad biológica

Abstract

"La formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura pre-existente se conoce como angiogénesis, participa en la reparación de tejidos y en respuestas inflamatorias. En condiciones normales existe un balance entre factores pro- y antiangiogénicos. Sin embargo, un desequilibrio en este proceso, conlleva en algunas circunstancias a una hiperproliferación de vasos sanguíneos, determinantes en patologías como el cáncer, la retinopatía diabética y en enfermedades cardiovasculares. Por estas implicaciones clínicas, ha despertado un interés considerable la búsqueda de nuevos agentes antiangiogénicos endógenos y sus mecanismos de acción. Las vasoinhibinas (VI) y la vasostatina (VS) son inhibidores naturales de la angiogénesis, que corresponden a fragmentos de grandes proteínas que por si mismas han perdido su capacidad angiogénica, derivan del extremo amino terminal de la prolactina (PRL) y de la calreticulina (CALR), respectivamente. El propósito del presente estudio fue llevar a cabo la producción de los fragmentos recombinantes activos: VI, VS y sus quimeras, vasoinhibina-vasostatina (VI-VS) y vasostatina-vasoinhibina (VS-VI) en Escherichia coli. Las proteínas recombinantes fueron expresadas en E. coli BL21SI mediante el vector de expresión pET12a, fueron analizadas en SDS-PAGE y cuantificadas por densitometría y western blot. Todas las proteínas fueron purificadas por cromatografía de afinidad en columnas de níquel. La producción de cada una de las proteínas a nivel de matraz fue de (mg/L): VS 6.87, VI 0.65, VS-VI 3.77 y VI-VS de 3.06, a nivel de biorreactor fue de (mg/L): VI 2.02, VS_VI 4 y VI_VS 0.39, lo que indica que la producción de las proteínas en este trabajo fue más eficiente en matraz que en biorreactor, no así para VI en donde su producción en biorreactor se vio incrementada, esto sugiere que es necesario optimizar las condiciones de cultivo a este nivel con el fin de mejorar la expresión de las proteínas recombinantes. Los resultados obtenidos mostraron que cada una de estas proteínas recombinantes, y sus quimeras, contienen los fragmentos activos antiangiogénicos, cuyo blanco biológico son las células endoteliales al mostrar un bloqueo en la proliferación de células endoteliales coronarias estimulada por sustancias vasoactivas como la Bradicidina. Estos hallazgos abrirán nuevas líneas de investigación en el desarrollo de novedosas herramientas biológicas en las terapia angiogénica."

"The formation of new blood vessels from the existing vasculature is known as angiogenesis, play a key role during wound healing process, tissues growth and inflammatory responses. In normal conditions a balance between pro- and antiangiogenic factors exist, however, a desbalance in this process, leads to, in some circumstances, an hiperproliferation of blood vessels, important in pathological diseases such as cancer, vasoproliferative retinopathies, rheumatoid arthritis and cardiovascular diseases. By these clinical implications, a considerable interest in search of novel antiangiogenic factors and its action mechanisms has awaked. The vasoinhibins (VI) and vasostatin (VS) are fragments released from Nterminal end of the human prolactin (hPRL) and calreticulin (CALR), respectively, those fragments are natural antiangiogenics. The aim of this study is the production of active recombinant fragments: VI, VS and their fusion proteins, vasostatin_vasoinhibin (VS_VI) and vasoinhibin-vasostatin (VI_VS). The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli BL21SI with the expression vector pET12a, the protein production were analyzed by SDS-PAGE, and Western blot quantification at bioreactor and flask level, also we quantified by densitometry in flask level. All proteins were purified by nickel affinity chromatography; the biological activity was evaluated in coronary endothelial cells (CEC). The protein production at flask level was (mg/L): VS 6.87, VI 0.65, VS-VI 3.77 and VI-VS 3.06; and at bioreactor level was (mg/L): VI 2.02, VS_VI 4.0 and VI_VS 0.39. In this study the protein production is more efficient in flask than bioreactor level, nevertheless, VI was able to improve its production at bioreactor level. We need optimize culture conditions at bioreactor level to improve the production of recombinant proteins. The results show that each recombinant proteins contain the active corresponding antiangiogenic fragments, whose biological target are endothelial cells that show an inhibition proliferation stimulated by vasoactive substances like Bradykinin (BK), fact that will open new lines of investigation for the development of novel biologic tools in the angiogenic therapy."