Caracterización funcional de dos sitios de degradación proteolítica tipo PEST de la dehidrina de nopal (OpsDHN1)

Abstract

"Las dehidrinas (DHNs) son proteínas desordenadas y altamente hidrofílicas que se acumulan en respuesta a factores de estrés abiótico en plantas. A pesar de su importancia en la respuesta al estrés, aún se conoce poco sobre estas proteínas, por lo que su mecanismo de acción y su regulación post-traduccional, son temas importantes para elucidar su función biológica. En este estudio se caracterizaron dos sitios de degradación proteolítica tipo PEST localizados en la región central y C-terminal de la DHN SK3 de Opuntia streptacantha (OpsDHN1). Las secuencias PEST son regiones enriquecidas en prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T), las cuales son señales para la degradación de proteínas a través de la vía ubiquitina-proteosoma 26S. Para evaluar la funcionalidad de las secuencias PEST de la proteína OpsDHN1 como etiquetas de degradación proteolítica, se generó una fusión traduccional entre el gen reportero GUS y el marco de lectura abierto de la OpsDHN1, esta construcción se evaluó en un ensayo de expresión transitorio en hojas de Nicotiana benthamiana y en un sistema de expresión estable generando líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana. En ambos sistemas, la construcción mostró un decremento de la señal de GUS. Así mismo, evaluamos sí cada secuencia PEST podría conducir a la degradación de la proteína reportera, para ello fusionamos una región que contenía cada secuencia PEST a GUS, donde observamos que cada secuencia PEST por separado, al igual que la versión completa son capaces de disminuir la actividad de GUS. De manera interesante, la actividad de la proteína reportera GUS se abatió cuando le fusionamos los últimos 126 residuos de la OpsDHN1 que incluyen las dos secuencias PEST. Por otro lado, cuando aplicamos el inhibidor del proteosoma MG132, éste disminuyó el proceso de degradación de la proteína GUS. Por último, realizamos un análisis bioinformático, en donde identificamos que las secuencias PEST son elementos comunes en las DHNs. Este estudio constituye el primer reporte de secuencias PEST involucradas en la degradación de DHNs, lo que es de gran importancia para la comprensión de cómo son reguladas este tipo de proteínas en las plantas."

"Dehydrins (DHNs) are disordered and highly hydrophilic proteins, which accumulates in plants in response to abiotic stresses. Despite their importance in the stress response, little is known about these proteins, therefore its mechanism of action and post-translational regulation are important processes to elucidate its biological function. In this study, we characterized two proteolytic PEST degradation sites located in the central region and Cterminal of Opuntia streptacantha SK3 DHN (OpsDHN1). PEST sequences are enriched in amino acid like proline (P), glutamic acid (E), serine (S) and threonine (T), which are signals for protein degradation by 26S proteasome-ubiquitin pathway. To evaluate the functionality of these PEST sequences as proteolytic degradation tags, we generated a translational fusion between the GUS reporter gene and the open reading frame of OpsDHN1, this construct was examined by transient and stable expression systems using Nicotiana benthamiana agroinfiltrated leaves and Arabidopsis thaliana transgenic lines. In both systems, the construction showed a strong decrease of GUS signal. Also, we evaluated whether each PEST sequence could lead to degradation of the reporter protein. To do this, we fused a region containing a single PEST sequence to GUS, we observed that individually, each separate PEST sequence was able to decrease the activity of GUS, in the same way as the full version. Interestingly, the GUS reporter protein activity was abated when we fused the last 126 residues that include two PEST sequences of OpsDHN1. Moreover, the treatment with proteasome inhibitor MG132 decreased the degradation processes of the GUS protein. Finally, we performed a bioinformatic analysis, where we identified that PEST sequences are common elements in the DHNs. This study is the first to report that PEST sequences are involved in the DHNs degradation, which gives important insights for understanding how these type proteins are regulated in plants."