Expresión y purificación de tres proteínas de fusión de hIL2 e hIFNγ en Escherichia coli

Abstract

"La interleucina humana 2 (hIL-2) y el interferón gamma humano (hIFN-γ) son citoquinas relevantes como terapia conjunta contra el cáncer. Las cepas de E. coli BL21 DE3 y BL21-SI son capaces de expresar proteínas recombinantes por medio del sistema T7 utilizando IPTG para BL21 DE3 y NaCl para BL21-SI como inductores. La producción de proteínas de fusión recombinantes ofrece diversas ventajas, implica menos pasos durante la producción y purificación. Por lo tanto, en este trabajo se evaluó la expresión de proteínas de fusión formadas por hIL-2 e hIFN-γ en E. coli BL21 DE3 y SI, estudiando tres proteínas de fusión: hIL2: hIFNγ, hIFNγ: hIL2 y hIFNγ: hIL2m, esta última contiene dos mutaciones puntuales realizadas en la fracción de hIL-2, T159S y K216E. Se evaluaron 20°C y 28°C como temperaturas de expresión, siendo esta la que mejor funcionó para producir las proteínas recombinantes. Utilizando anticuerpos específicos para hIFNγ y hIL2 se identificaron ambas citocinas en la fracción insoluble de los cultivos con las cepas E. coli BL21 DE3 y SI; observándose una concentración de 11.56 mg/L hasta 29.4 mg/L de proteínas al utilizar la cepa BL21-SI. Se requirió una etapa de solubilización antes de proceder con la purificación. Las tres proteínas de fusión se purificaron por separado mediante cromatografía de afinidad. Se recuperó entre el 35% y el 89% de la proteína recombinante del lisado celular, obteniendo porcentajes de pureza entre el 40% y el 85%, alcanzando 29.4 mg/L de proteína recombinante."

"The human interleukin 2 (hIL-2) and human interferon gamma (hIFN-γ) are relevant cytokines used as combined cancer therapy. The strains of E. coli BL21 DE3 and BL21-SI are known to be capable of over expressing recombinant proteins by means of the T7 system using IPTG for BL21DE3 and NaCl for BL21-SI as inducers. The production of recombinant fusion proteins is advantageous, involves less steps during purification and production. Therefore, in this work we evaluated the expression of fusion proteins formed by hIL-2 and hIFN-γ in E. coli BL21 DE3 and SI in different arrays such as hIL2: hIFNγ, hIFNγ: hIL2 and hIFNγ: hIL2m, the latter contains two point mutations located in the fraction of hIL-2, T159S and K216E. We tested 20°C and 28°C as temperatures of expression, the last one improved the production of the recombinant proteins. The identity of these proteins was confirmed using specific antibodies for hIFNγ or hIL2 in the insoluble fraction of the cultures of E. coli strains BL21 DE3 and SI. Concentrations of recombinant proteins ranged of 11.56 mg / L up to 29.4 mg / L of proteins when using strain BL21-SI. A solubilization step was required prior proceeding with purification; all three fused proteins were purified separately by affinity chromatography. Between 35% and 89% of the recombinant protein from the whole lysate was recovered, obtaining a purity percentage between 40 % and 85 % and up to 29.4 mg/L of the fusion proteins."