Análisis in silico, clonación, expresión heteróloga y purificación parcial de CYP745C2

Abstract

"Citocromo P450 (CYP) es el nombre distintivo que recibe una amplia familia de hemoproteínas. La mayoría de estas enzimas tienen actividad de monooxigenasa, que catalizan o transfieren un sólo átomo de oxígeno al substrato. Estas enzimas están involucradas en el metabolismo de muchos xenobióticos como medicamentos, pesticidas, agentes cancerígenos y productos químicos contaminantes del medio ambiente. Las CYP de microalgas son un campo sin explorar, considerando que se ha caracterizado bioquímicamente un sólo citocromo P450 de microalgas (Cook et al., 2016; Gong et al., 2018). En el presente trabajo se analizó la secuencia de aminoácidos de CYP745c2 reportada en la base de datos de genomas de microalgas. Este análisis in silico se realizó utilizando las herramientas PFAM, InterPro, MycoCosm, TMHMM, NCBI y MEGA X. La secuencia nucleotídica correspondiente fue optimizada para el uso de codones y expresión heteróloga en Escherichia coli. Los datos obtenidos del análisis in silico sugieren que es una secuencia relacionada a la familia de enzimas citocromo P450. Hasta el momento se ha clonado el gen CYP745c2 y la construcción pET28pps-CYP745c2 se ha verificado por secuenciación; de igual forma se han establecido las condiciones de expresión de la proteína recombinante CYP745c2 usando la cepa BL21 (DE3) Arctic de E. coli y su purificación parcial por cromatografía de afinidad a níquel. Finalmente, un experimento de caracterización espectral de monóxido de carbono sugiere la presencia de un citocromo P450."

"Cytochrome P450 (CYP) is the distinctive name for a large family of hemoproteins. Most of these enzymes have monooxygenase activity, which catalyzes or transfers a single oxygen atom to the substrate. These enzymes are involved in the metabolism of many xenobiotics such as drugs, pesticides, carcinogens, and chemicals that pollute the environment. Microalgal CYPs are an unexplored field, considering that only a single microalgal CYP has been biochemically characterized (Cook et al., 2016; Gong et al., 2018). The present research focuses on the CYP745c2 annotated in the database of microalgae genomes. An in silico analysis of the nucleotide sequence of CYP745c2 was carried out, using tools such as PFAM, InterPro, MycoCosm, TMHMM, NCBI and MEGA X. The corresponding nucleotide sequence was optimized for codon usage and heterologous expression in Escherichia coli. The data obtained from the in silico analysis suggests that it is a sequence related to the cytochrome P450 enzyme family. To date the CYP745c2 gene has been cloned and the construct pET28pps-CYP745c2 has been verified by sequencing; conditions for the expression of the recombinant CYP745c2 protein have been established using the E. coli strain BL21 (DE3) Arctic and the protein has been partially purified by nickel affinity chromatography. Finally, a carbon monoxide spectral assay suggests the presence of a P450 cytochrome."