Reconocimiento molecular en interacciones proteína-ligando: estabilidad de CGI-58 y estructura cristalográfica de SdrP/ADN

Abstract

"El reconocimiento molecular es el proceso de interacción de macromoléculas biológicas entre sí o con varias moléculas pequeñas para formar un complejo específico, y constituye la base de todos los procesos en los organismos vivos, como en el catabolismo de triglicéridos y la expresión de genes. En el caso de la lipólisis, estudiamos a la proteína CGI-58, cuya función de activación de la lipasa ATGL es regulada por su interacción con la proteína de periferia PLIN1 y su unión a la gota lipídica. Una vez que la lipólisis es estimulada por catecolaminas, la fosforilación mediada por PKA permite la disociación del complejo CGI-58/PLIN1 y el reclutamiento de las lipasas ATGL, HSL y MGL para iniciar la liberación de los ácidos grasos almacenados en los triglicéridos. En este trabajo, evaluamos la estabilidad y solubilidad de la proteína CGI-58 WT y las mutantes 3WA y 3WA/S237E. Nuestros resultados mostraron que los triptófanos tienen un efecto en el estado de agregación de la proteína, ya que las mutantes 3WA y 3WA/S237E se encuentran mayormente como monómero en comparación con la proteína WT que tiende a agregarse. También determinamos que la mutante en el sitio de fosforilación favorece un incremento en la estabilidad térmica y el contenido de estructura secundaria en comparación con la 3WA, lo que sugiere que la fosforilación tiene un rol en la integridad de la proteína. En el caso de la transcripción, el factor SdrP que pertenece a la familia CRP/FNR, regula principalmente la expresión de genes del metabolismo energético y de reparación durante la fase estacionaria. El presente estudio muestra la estructura cristalográfica de SdrP en complejo con la secuencia consenso de ADN, determinamos que el “doblez” del ADN es diferente al reportado previamente para el factor de transcripción CAP, esto como resultado de los aminoácidos que realizan el contacto directo con el ADN (R160, E161, K165 y Y180) y las interacciones indirectas de la proteína con el ADN, que difieren respecto a CAP. Finalmente, determinamos la importancia de la participación de la Y180 en la interacción directa con el ADN, un residuo externo al motivo hélice-giro-hélice que no se había descrito en la familia CRP/FNR."

"Molecular recognition is the process of interaction of biological macromolecules with each other or with several small molecules to form a specific complex and is the basis of all processes in living organisms, such as triglyceride catabolism and gene expression. In lipolysis, we studied the CGI-58 protein, whose function as a co-activating protein of ATGL is regulated by its interaction with periphery protein PLIN1 and its binding to the lipid droplet. Once lipolysis is stimulated by catecholamines, PKA-mediated phosphorylation triggers the dissociation of the CGI-58/PLIN1 complex, allowing the recruitment of ATGL, HSL, and MGL lipases to initiate the release of fatty acid stored in triglycerides. In this work, we evaluated the stability and solubility of the CGI-58 WT protein and the 3WA and 3WA/S237E mutants. Our results showed that tryptophan residues have an effect on the aggregation state of the protein, as the 3WA and 3WA/S237E mutants were mostly found as monomers compared to the WT protein, which tends to aggregate. We also established that the phosphorylation site mutant increases the thermal stability and secondary structure content of the 3WA/S237E compared to 3WA, suggesting that phosphorylation has a role in protein integrity. In transcription, the stationary phase-dependent regulatory protein (SdrP), which belongs to the CRP/FNR family, activates transcription at promoters related to energy metabolism and repair during the stationary phase. The present study shows the X-ray crystal structure of SdrP in complex with its consensus DNA binding sequence. We showed that DNA bending differs from what has been previously reported for CAP due to the differences observed in amino acids that participate in direct (R160, E161, K165, and Y180) and indirect recognition of DNA. Finally, we determined the participation of Y180 in the direct interaction with DNA, a residue located outside of the helix-turn-helix DNA binding motif that has not been described before in the CRP/FNR family."