Identificación del sitio de inserción del transgén en los ratones Δ-202

Abstract

"Los astrocitos constituyen el tipo celular más abundante y los astrocitomas son el cáncer más frecuente del sistema nervioso central (SNC). La línea murina Δ202 (modelo transgénico de astrocitoma desarrollado en nuestro grupo) fue obtenida a partir de un cigoto microinyectado con la construcción SVΔ202. Los ratones homócigos para el transgén desarrollan un síndrome neurológico (SN) caracterizado por parálisis, atrofia y proliferación de astrocitos. Tres hipótesis alternativas pueden explicar la patogenia del SN: el transgén 1) inactiva un antioncogén astrocito-específico, 2) activa un protooncogén astrocito-específico o 3) genera un polipéptido de fusión oncogénico. Para poner a prueba estas hipótesis es necesario identificar primero el sitio de inserción del transgén en el genoma murino. Con este propósito empleamos la técnica de PCR inversa (PCRi), que permite amplificar las secuencias desconocidas que flanquean a una secuencia conocida o transgén. En un trabajo preliminar identificamos una secuencia de 797 pares de bases (pb) con homología del 98% al segmento chr3:36422278-36422935; como esta secuencia carecía de los extremos del transgén, no podía asegurarse que flanqueara al transgén. En este trabajo extendimos la estrategia de amplificación del transgén hacia los flancos genómicos mediante tres reacciones sucesivas de PCRi anidada, empleando tres parejas de oligonucleótidos localizadas cada vez más cerca de los extremos del transgén. Amplificamos DNA Δ202 que había sido fragmentado con Bam HI (B), Eco RI (E) o Xba I (X) y obtuvimos seis productos que pudieron ser clonados y secuenciados. Las clonas derivadas de DNA digerido con E y B sólo permitieron identificar secuencias del transgén pero las derivadas de DNA digerido con X permitieron identificar los extremos derecho e izquierdo del transgén y las secuencias murinas que los flanquean, las cuales coincidieron con la secuencia de 797 pb. Nuestros resultados confirman el sitio de inserción del transgén en la región chr3:36422278-36422935, que interviene en la diferenciación de los astrocitos y el desarrollo del SNC."

"Astrocytes are the most abundant cell type and astrocytomas the most frequent cancer of the central nervous system (CNS). The Δ202 mouse line (transgenic astrocytoma model developed by our group) was obtained from a zygote microinjectied with the SVΔ202 construct. Mice homozygous for the transgene develop a neurologic syndrome (NS) characterized by paralysis, atrophy and astrocyte proliferation. Three alternative hypotheses might explain the pathogenesis of the NS: the transgene ether 1) inactivates an astrocyte-specific antioncogene, 2) activates an astrocyte-specific protooncogene or 3) generates an oncogenic fusion polypeptide. To test these hypotheses the transgene insertion site in the mouse genome must be identified. To attempt this we used reverse PCR (rPCR), which allows amplification of the unknown sequences flanking a known sequence or a transgene. Our preliminary rPCR results had identified a 797 base pair (pb) seq uence with 98% homology to the segment chr3:36422278-36422935 of chromosome 3, lacking the transgene ends and thus unable to assure that the sequence flanked the transgene. In this work we extended the amplification strategy towards the genomic flanks using two successive nested rPCR reactions with three oligonucleotide pairs, each located closer to the transgene ends. From Δ202 DNA fragmented with Bam HI (B), Eco RI (E) or Xba I (X) we obtained six amplificaiton products that could be cloned and sequenced. The clones derived from DNA digested with E and and B allowed the identification of transgene sequences only, whereas those derived from DNA digested with X allowed the identification of the right and left transgene ends as well as the mouse genomic sequences flanking them, which coincided with the 797 pb sequence. Our results confirm the transgene insertion site in the chr3:36422278-36422935 region, which is involved in astrocyte differentiation and CNS development."