Estudios de la cooperatividad entre proteínas motoras y los efectos de estabilizar microtúbulos con glutaraldehído

Abstract

"En esta tesis se estudio la cooperatividad entre proteínas motoras y los efectos de sobre la funcionalidad de microtúbulos al estabilizarlos con glutaraldehído. La cinesina es un motor molecular biológico de tamaño nanométrico que convierte la energía química de la hidrólisis de ATP en trabajo mecánico. En la célula, la cinesina participa en el transporte intracelular, frecuentemente en grupos, llevando organelos o vesículas hacia el extremo más (+) de filamentos celulares conocidos como microtúbulos. Por otra parte, existen propuestas de aplicaciones nanotecnológicas basadas en conjuntos de cinesinas transportando nanopartículas a lo largo del microtúbulo. Por estas razones, es necesario: 1) Comprender cómo coopera entre sí un conjunto de cinesinas y 2) Estabilizar a los microtúbulos por periodos prolongados. Realizar estos estudios son los objetivos de esta tesis, empleando ensayos de motilidad in-vitro en los que cinesinas unidas a una esfera de poliestireno se desplazan sobre microtúbulos fijos sobre una superficie. Utilizando un sistema de pinzas ópticas es posible medir desplazamientos y fuerzas desarrolladas por la cinesina. Respecto al primer objetivo, se realizaron mediciones variando el número de cinesinas por esfera. Encontramos que una sola cinesina desarrolla fuerzas de 4.5 pN y permanece sobre el microtúbulo un promedio de 0.3 s. En cambio, para conjuntos de más de una cinesina la fuerza se incrementa a 5.2 pN y el tiempo de permanencia es de 0.5 s. Estos resultados indican que grupos de dos o más cinesinas cooperan entre sí. Respecto al segundo objetivo, se desarrolló un protocolo de estabilización de microtúbulos utilizando glutaraldehído. Estos microtúbulos resultaron estables aún después de varias semanas, además de que demostraron ser funcionales, lo cual se comprobó mediante ensayos de motilidad con cinesina."

"In this thesis, the cooperativity between a motor protein and the stabilizing effects of the microtubule glutaraldehyde has been studied. Kinesin is a biological molecular motor of the nano scale that has a function of converting chemical energy from ATP hydrolysis into mechanical work. This molecular motor is involved in intracellular transport of cargo such as clusters, organelles or vesicles, leading them to the periphery of the cell through filaments called microtubules. Moreover, there have been proposals of nanotechnological applications for kinesin to carry specific nanoparticles along microtubules. With these reasons in mind, it is necessary to first: 1) Understand how group of kinesin motors cooperate with one another as a group and 2) To stabilize microtubules for prolonged periods of time. In this dissertation, we performed these studies using in vitro motility assays in which kinesin was attached to a polystyrene bead and let to stick and move along a fixed microtubule. It is possible to measure the displacements and forces developed by kinesin using an optical tweezers system. Regarding our first experimental goal, measurements were made by varying the number of kinesins per area. It was found that a single kinesin developed forces of 4.5 pN and remained on the microtubule 0.3 s on average, whereas, for sets including more than a single kinesin the force increased up to 5.2 pN and their time of residence was 0.5 s. These results indicate that groups of more than one kinesin do cooperate between each other within the group. In regards to our second goal, we developed a protocol for microtubule stabilization using glutaraldehyde. Microtubules were observed to be stable after several weeks and that proved to be functional, which was checked by kinesin motility assays."