Desnaturalización térmica de productos de amplificación para genotipificar las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis

Abstract

"OBJETIVO. Desarrollar un método de qPCR basado en la desnaturalización térmica de amplicones del rDNA 16S y regiones de diferencia (RD1, RD4, RD9) del Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB). MÉTODOS. Diseñamos parejas de oligonucleótidos para generar amplicones de rDNA 16S del CMTB y de RD1, RD4 y RD9 de las cepas de referencia M. tuberculosis (MTB) H37Rv, M. bovis (MB) AN5 y MB BCG str. México. Determinamos la temperatura de desnaturalización térmica (Tm) de los amplicones en presencia de EvaGreen. Con plásmidos derivados de pGEM-T Easy con insertos de los amplicones de referencia controlamos los ensayos de genotipificación de tres mezclas de qPCR: preliminar (para rDNA 16S), D1 (para RD9+/RD1 ) y D2 (para RD4+/RD4 ) validadas con DNA de 44 cepas de un panel de micobacterias CMTB (MTB y MB) y no-CMTB (MNTB). RESULTADOS. Los insertos de rDNA16S, RD1 , RD4+, RD4 y RD9 tuvieron los tamaños y secuencias esperadas y valores de Tm característicos que permitieron diferenciar RD9+ de RD1 en la mezcla D1 (Tm = 1.4 °C) y RD4+ de RD4 en la mezcla D2 (Tm = 1.53 °C). Los genotipos identificados tuvieron las siguientes concordancias con las asignaciones del panel: CMTB (MTB+MB+MA) 39/39 (100%), MTB+MA 22/23 (95.7%), MB 16/16 (100%), NMTB: 5/5 (100%). El nuevo método identificó correctamente nueve de 10 aislados de MTB y tres de tres de MB y distinguió el genotipo MA en cinco de las 23 cepas del panel asignadas a MTB. CONCLUSIONES. Aparte de ser más rápido y fácil de interpretar que la espoligotipificación, el nuevo método es menos laborioso, identifica los tres genotipos del panel (MTB, MB y MNTB), distingue el genotipo MA en cepas del panel asignadas a MTB, e identifica aislados de TB humana y bovina."

"AIM. To develop a qPCR method based on thermal denaturation of amplicons from 16S rDNA and three regions of difference (RD1, RD4, RD9) of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). METHODS. We designed oligonucleotide pairs to generate 16S rDNA amplicon, RD1, RD4 and RD9 amplicons of the M. tuberculosis (MTB) H37Rv, M. bovis (MB) AN5 and MB BCG str. Mexico reference strains. Thermal denaturation temperature of (Tm) values of the amplicons were determined in the presence of EvaGreen. With plasmids derived from pGEM-T Easy containing inserts of the reference amplicons we controlled the genotyping assays of three qPCR mixes: preliminary (for rDNA 16S), D1 (for RD9+ / RD1-) and D2 (for RD4+ / RD4-) validated with DNA from a mycobacterial panel of 44 MTC (MTB and MB) and non-MTC (MNTB) strains of the Mexican Institute of Epidemiological Diagnosis and Reference (InDRE). RESULTS. The rDNA16S, RD1-, RD4 +, RD4- and RD9 inserts had the sizes and sequences expected, and their characteristic Tm values differentiated RD9+ from RD1- in the D1 mix (ΔTm = 1.4 ° C), and RD4+ from RD4- in the D2 mix (ΔTm = 1.53 ° C). The genotypes identified had the following concordance with those assigned in the panel: MTC (MTB+MB+MA) 39/39 (100%), MTB+MA 22/23 (95.7%), MB 16/16 (100%), NMTB 5/5 (100%). The new method identified correctly 9/10 MTB isolates and 3/3 MB isolates and distinguished the MA genotype in five of the 23 strains assigned to MTB. CONCLUSIONS. Our qPCR method is faster, easier to interpret and less laborious than spoligotyping, identifies the three genotypes of the panel (MTB, MB and MNTB), and distinguishes the MA genotype among panel strains assigned to MTB, and identifies human and bovine TB isolates."