Detección ultrasensible de virus del papiloma humano tipo 16 por autoensamble catalítico de horquillas de ADN y espectroscopía Raman

Abstract

"El cáncer cervicouterino (CC), la segunda causa de muerte por cáncer de las mujeres es provocado por la infección persistente de uno o más de los 40 tipos anogenitales de virus del papiloma humano (VPH) donde predominan los tipos 16 y 18, asociados al 70% de los casos de CC. Los programas de tamizaje del CC se basan en dos pruebas primarias: Papanicolau y detección del ADN de VPH; la segunda, usualmente basada en PCR, es más sensible y específica para detectar lesiones neoplásicas tempranas. El ensamble catalítico de horquillas (ECH) seguido por espectroscopía Raman aumentada por superficie (SERS, Surface enhanced Raman spectroscopy), podría reemplazar las pruebas de PCR para el tamizaje de CC, especialmente en poblaciones de escasos recursos. El objetivo de este proyecto fue iniciar el desarrollo de un ensayo ECH-SERS para los oncogenes E6 de VPH 16 y 18. Diseñamos ocho oligonucleótidos lineales de 50-55 bases, con secuencias “forward” y “reverse” complementarias a las de los oncogenes E6 de VPH 16 y 18, los cuales formarían cuatro parejas de horquillas etiqueta (hE) y sensor (hS): dos “forward” (hE16F/hS16F, hE18F/hS18F) y dos “reverse” (hE16R/hS16R, hE18R/hS18R). Todos los oligonucleótidos tienen un grupo tiol en el extremo 5’ para conjugar las hE a nanopartículas de oro (AuNP) y las hS a 4-mercaptobenzonitrilo (MBN) cuya señal Raman puede ser amplificada hasta 10 órdenes de magnitud en la cercanía con AuNP. Sintetizamos AuNP esféricas monodispersas con diámetro promedio de 20 nanómetros (nm), determinado por microscopía electrónica de barrido, y absorción de luz con un pico a 520 nm. La electroforesis en geles de poliacrilamida mostró que la incubación de los ocho oligonucleótidos a 37 °C aumentó la intensidad de las bandas, esperada por la formación de horquillas. Los diámetros hidrodinámicos promedio determinados por dispersión dinámica de luz en AuNP intactas y conjugadas con oligonucleótidos para hE16F y hS16F fueron respectivamente 23.28 nm, 34.11 nm y 36.72 nm. El ensayo ECH-SERS preliminar con la pareja de horquillas hE16F/hS16F conjugadas fue exitoso, pues detectó señales SERS solamente en muestras con ADN de VPH 16."

"Cervical cancer (CC), the second cause of cancer death in women, is caused by persistent infection with one or more of the 40 anogenital types of human papillomavirus (HPV), where types 16 and 18 predominate, associated with 70% of CC cases. CC screening programs are based on two primary tests: Pap smear and HPV DNA detection; the second, usually based on PCR, is more sensitive and specific for detecting early neoplastic lesions. Catalytic hairpin assembly (ECH) followed by surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) could replace PCR tests for CC screening, especially in low-income populations. The objective of this project was to initiate the development of an ECH-SERS assay for the E6 oncogenes of HPV 16 and 18. We designed eight linear oligonucleotides of 50-55 bases, with “forward” and “reverse” sequences complementary to those of the oncogenes. E6 of HPV 16 and 18, which would form four pairs of tag (hE) and sensor (hS) forks: two “forward” (hE16F/hS16F, hE18F/hS18F) and two “reverse” (hE16R/hS16R, hE18R/hS18R ). All oligonucleotides have a thiol group at the 5' end to conjugate the hE to gold nanoparticles (AuNP) and the hS to 4-mercaptobenzonitrile (MBN) whose Raman signal can be amplified up to 10 orders of magnitude in the vicinity of the AuNP. We synthesized monodisperse spherical AuNPs with average diameter of 20 nanometers (nm), determined by scanning electron microscopy, and light absorption with a peak at 520 nm. Electrophoresis in polyacrylamide gels showed that incubation of the eight oligonucleotides at 37 °C increased the intensity of the bands, expected by the formation of hairpins. The average hydrodynamic diameters determined by dynamic light scattering on intact and oligonucleotide-conjugated AuNPs for hE16F and hS16F were respectively 23.28 nm, 34.11 nm, and 36.72 nm. The preliminary ECH-SERS assay with the conjugated hE16F/hS16F hairpin pair was successful, detecting SERS signals only in samples with HPV 16 DNA."