Producción de proteínas recombinantes contra el Virus Sincicial Respiratorio en dos sistemas de expresión: Escherichia coli y plantas de tabaco

Abstract

"El Virus Sincicial Respiratorio (VSR) es un virus que afecta a personas de todas las edades, sin embargo, puede causar una infección respiratoria aguda (IRA) en infantes y adultos mayores de 60 años. Este virus suele aparecer en la época de otoño a invierno y se estima que infecta a 64 millones de personas y causa 160,000 muertes por año a nivel mundial. Recientemente la FDA aprobó dos vacunas basadas en la secuencia de la proteína de pre-fusión del VSR (pre-F), las cuales aún no están disponibles en países de bajos ingresos. En este trabajo se emplearon dos sistemas de expresión para producir proteínas recombinantes contra el VSR, que puedan usarse como un prototipo de vacuna; en primer lugar, se seleccionó a Escherichia coli por su rápido crecimiento y rentabilidad y en segundo lugar a las plantas de tabaco por ser una plataforma prometedora debido a su rentabilidad, escalabilidad y la facilidad de posible uso en vacunación oral. En nuestro grupo de investigación contamos con el gen BFVax que contiene regiones que codifican epítopos de la proteína F del VSR, y adicionalmente se diseñó un nuevo gen PreFVac, que contiene regiones de la proteína de pre-fusión del VSR y otras regiones relevantes para mejorar la construcción. Se indujo la expresión de ambas proteínas en E. coli con IPTG 1mM y se realizó la extracción por medio de lisis bacteriana y purificación por columna con resina de níquel. Por otro lado, se realizó la expresión transitoria de la proteína BFVax y PreFVac en tabaco por el método de módulos de vectores virales “Magnifection” y la transformación se realizó por agroinfiltración. La mayor cantidad de proteínas recombinantes extraídas de bacterias se encontraron en la fracción insoluble y después de su purificación se detectaron por Western blot. Además, las fracciones obtenidas de la purificación se concentraron y diluyeron en PBS y se cuantificaron por el método de Bradford, obteniendo los resultados de 292 μg/mL de PreFVac y de 24 μg/mL de BFVax de la proteína insoluble total. En cuanto a las proteínas obtenidas en planta, se pudieron detectar por Western blot y dot blot. Se lograron expresar y purificar en E. coli, dos proteínas putativamente antigénicas para VSR, además ambas se produjeron en tabaco por el método de Magnifection. Se pretende usar estas cuatro proteínas en ensayos de inmunización para comparar su eficiencia biológica."

"Respiratory Syncytial Virus is a virus that affects people of all ages; however, it can cause an acute respiratory infection (ARI) in infants and adults over 60 years. This virus appears in the fall to winter season and is estimated to infect 64 million people and to cause 160,000 deaths per year worldwide. Recently, FDA approved two vaccines based on the RSV pre-fusion protein (pre-F) sequence, which are not yet accessible to low-income countries. In this work, two expression systems were used to produce antigenic recombinant RSV proteins that may serve as a prototype vaccine; first, E. coli was selected for its rapid growth and profitability and secondly, tobacco plants for being a promising platform and their cost-effectiveness, scalability, and ease of possible use in oral vaccination. Our research group has the BFVax gene containing regions encoding epitopes of the RSV F protein and additionally a new PreFVac gene was designed, containing regions of the RSV pre-fusion protein and other relevant regions to improve the construct. Protein expression was induced in E. coli with 1mM IPTG and the extraction was performed by bacterial lysis; purification was performed by column with nickel resin. On the other hand, transient expression of BFVax protein was performed in tobacco by the method of viral vector modules "Magnifection" and transformation was performed by agroinfiltration. The highest amount of recombinant proteins extracted from bacteria were found in the insoluble fraction and after purification they were detected by Western blot. Furthermore, the fractions obtained from the purification were concentrated and diluted in PBS and quantified by the Bradford method, obtaining the results of 292 µg/mL of PreFVac and 24 µg/mL of BFVax of the total insoluble protein. As for the proteins obtained in plant, they could be detected by Western blot and dot blot. It was possible to express and to purify in E. coli two proteins putatively antigenic against RSV, additionally both were produced in tobacco by the Magnifection method. We intend to use these four proteins in immunization assays to compare their biological efficiency. "