Análisis inmunológico de una proteína contra influenza A H1N1 producida en microalgas y diseño de una proteína antigénica contra influenza A H1N1 y A H3N2

Abstract

"El virus de la influenza tipo A causa infecciones y complicaciones respiratorias y ha protagonizado pandemias con un alto número de muertes. La vacunación es la herramienta fundamental para combatir la enfermedad y sus efectos a largo plazo. Debido a que el virus de la influenza tiene una alta tasa de variación génica, es necesario la actualización de vacunas cada año con base en las variantes circulantes. Se han implementado diferentes plataformas de fabricación de vacunas que son rentables con mejor rendimiento y de fácil acceso. En el presente trabajo se usó la microalga Chlamydomonas reinhardtii como plataforma de producción de la proteína antigénica (P.A.), que contiene algunos epítopos relevantes del virus de la influenza A H1N1. La proteína recombinante P.A. se expresó en E. coli. y también en C. reinhardtii por transformación nuclear y de cloroplasto. Se detectó P.A. de los extractos mediante SDS-PAGE y se corroboró por Western Blot. Se realizó una purificación de P.A. producida en E. coli mediante cromatografía de afinidad a níquel. La producción de P.A. en el núcleo de microalgas fue de 1.6748 mg por gramo de biomasa seca, en comparación con la de cloroplastos que fue de 1.3046 mg y fue utilizada junto con P.A. producida en E. coli BL21-Rosetta, para inmunizar ratones BALB/c. Se obtuvieron sueros de los ratones inmunizados y se detectó la producción de títulos de anticuerpos de tipo IgG después de la primera inmunización, y se encontró que los títulos disminuyeron después de la segunda inmunización. La producción de IgM fue similar al control de PBS y no se detectó producción de IgA. Hubo producción basal de IgE no cuantificable. En lavados traqueopulmonares hubo producción basal de IgG, y no se detectó en los lavados gastrointestinales. Por otra parte, se realizó la construcción de otro gen antigénico mejorado con los epítopos relevantes del virus de la influenza A H1N1 y A H3N2, mediante el uso de un análisis bioinformático, para la detección de las regiones conservadas y antigénicas, modelado en 3D y análisis de alergenicidad. Este análisis confirmó que la construcción teóricamente contiene epítopos que se presentan a MHC I y II, son conservados, y que tentativamente no generarían una reacción alergénica, además de contener regiones para un balance inmunitario Th1/Th2. En conclusión, la microalga C. reinhardtii puede producir proteínas recombinantes, pero es necesario probar posibles rutas de inmunización mixtas y un análisis de la dosis adecuada para una mejor respuesta inmunogénica en ratones."

"The influenza type A virus causes infections and respiratory complications, and it has been at the center of pandemics with a high number of deaths. Vaccination is the fundamental tool to combat the disease and its long-term effects. Because the influenza virus has a high rate of genetic variation; it is necessary to update the vaccines every year based on the circulant variants. Different platforms for vaccine development have been implemented that are cost-effective with better performance and easy accessibility. In this work, we used the microalgae Chlamydomonas reinhardtii as a platform to produce the antigenic protein (P.A.), which harbors some relevant epitopes of the influenza A H1N1 virus. The recombinant protein P.A. was expressed in E. coli and in C. reinhardtii by nuclear and chloroplast transformation. Detection of P.A. was confirmed by SDS-PAGE and corroborated by Western Blot. A purification of P.A. produced in E. coli was performed by nickel affinity chromatography. The production of P.A. in microalgae nucleus was 1.6748 mg per gram of dry biomass, compared to that of chloroplasts, which was 1.3046 mg biomass, microalgae nucleus was a little higher than that expressed in chloroplast and was used together with P.A. produced in E. coli BL21-Rosetta to immunize BALB/c mice. Sera were obtained from immunized mice and production of IgG antibody titers was detected after the first immunization, but it was found that the titers decreased after the second immunization. IgM production was like the PBS control, and production of IgA was not detected. The production of IgE was basal unquantifiable. In tracheopulmonary lavages of the mice the production of IgG was basal, and it was not detected in gastrointestinal lavages. In other hand, the construction of another improved antigenic gene with the relevant epitopes of the influenza A virus H1N1 and H3N2 was performed, by means of the bioinformatic analysis for the detection of the conserved and antigenic regions, 3D modeling and allergenicity analysis. This analysis confirmed that the construct theoretically contains epitopes that are presented to MHC I and II, are conserved and that tentatively would not generate an allergenic reaction, in addition to containing regions for a Th1/Th2 immune balance. In conclusion, the microalga C. reinhardtii can produce recombinant proteins, but it is necessary to test possible mixed immunization routes plus an analysis of the appropriate dose for a better immunogenic response in mice."